摘要
本文建立了一種使用液相色譜儀檢測疫苗中苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯防腐劑殘留的方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，離心濾過后上機(jī)分析。
?
實驗結(jié)果顯示：空白溶液不干擾含量測定，方法專屬性較好；對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，四種防腐劑色譜峰保留時間和峰面積的RSD%在0.07%-0.12%和0.05%-0.35%之間，儀器精密度良好；以外標(biāo)法定量，在 0.5-50μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均>0.9999，準(zhǔn)確度在98.3%-107.7%之間；加標(biāo)回收和精密度實驗測試表明，方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可為疫苗及生物制品中四種防腐劑殘留測定提供參考。
關(guān)鍵詞：防腐劑殘留 疫苗 液相色譜儀 Shim-pack GIST C18
前言
防腐劑在疫苗生產(chǎn)過程中主要用于抑制微生物生長，是一類重要物質(zhì)。目前除了硫柳汞外，在生物制品及醫(yī)藥防腐劑中還常見如苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯。在《中國藥典》三部（2020 版）中，苯酚按照通則 3113 進(jìn)行檢測，使用滴定顯色法進(jìn)行測定，含量應(yīng)不高于 3.0g/L；間甲酚按照通則 3114 使用比色法進(jìn)行測定，含量不高于 2.5g/L；2 - 苯氧乙醇按照附錄2液相色譜法進(jìn)行檢測，應(yīng)為4.0-6.0mg/mL。
目前不同防腐劑使用不同的檢測方法，對于檢測機(jī)構(gòu)來說方法種類多且工作量大，而滴定法靈敏度及誤差較大，需要工作人員有一定的視覺靈敏度和長期操作經(jīng)驗。目前亟需開發(fā)能同時快速用于生物制品中多種防腐劑的快速檢測方法。
液相色譜儀作為一種常見便捷的色譜分析系統(tǒng)，在含量分析監(jiān)測中廣泛使用。本文建立了一種采用液相色譜儀對生物制品中苯酚、間甲酚、2 - 苯氧乙醇、羥苯甲酯殘留量同時檢測的分析方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析，前處理簡單、分析速度快、靈敏度高，可供相關(guān)檢測人員參考。
1.1 儀器
本實驗采用島津超高效液相色譜儀 LC-40，具體配置為：
系統(tǒng)控制器：CBM-40lite
脫氣機(jī)：DGU-20A
輸液泵：LC-40B XRX2
自動進(jìn)樣器：SIL-40CXR
柱溫箱：CTO-40C
檢測器：SPD-40V
色譜工作站：LabSolutions Ver.5.99
1.2 分析條件
液相色譜條件
色譜柱：Shim-pack GIST C18，2.0μm，100mmx2.1mm；P/N：227-30001-04；
流動相：A-水；B-乙腈
流速：0.4mL/min
柱溫：40℃
進(jìn)樣體積：5μL
檢測波長：220nm、270nm
洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為10%，時間程序見表 1。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
以75%乙腈水溶液配制苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液 (1000μg/mL)，同時逐級稀釋為 0.5、1、2、5、10、20、50μg/mL共6個標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，待測。
1.4 樣品前處理
準(zhǔn)確取100μL樣品溶液，加入300μL乙腈，渦旋混勻，14000rpm離心5min，上機(jī)分析。
結(jié)果與討論
2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性和分離度
按照 1.2 中分析條件測試對照品溶液，色譜圖如圖 1 所示。通過梯度洗脫方式，四種化合物分離度良好，且分離度均大于 3（詳見圖 2），滿足液相色譜中關(guān)于定量色譜分離度要求。
2.2 專屬性
取空白溶劑進(jìn)行測定，色譜圖如圖3所示。在 270nm（羥苯甲酯定量通道）和 220nm（苯酚、2-苯氧乙醇、間甲酚定量通道）波長下，對照品（0.5ppm）中四種物質(zhì)出峰位置處同空白溶劑色譜圖相比均無干擾，專屬性良好。
2.3 線性關(guān)系
按照1.3配制 6 個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.2中的分析條件進(jìn)行測定。羥苯甲酯以 270nm 作為定量通道，苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇以220nm作為定量通道，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。（請參考文末附件）
2.4 精密度實驗
按照1.2分析條件，分別取0.5μg/mL、20μg/mL對照品溶液上機(jī)測試，并計算各化合物保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)，以評價系統(tǒng)的檢測結(jié)果的重復(fù)性。表3結(jié)果顯示，目標(biāo)物保留時間和峰面積的RSD分別在0.07%-0.12%和 0.05%-0.35%之間。精密度實驗結(jié)果表明，儀器精密度良好。
2.5 樣品檢測和加標(biāo)回收實驗
使用本方法檢測了A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物原液樣品，在陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制為兩個不同濃度的加標(biāo)樣品，每個濃度平行制備三份，按照1.4處理后上機(jī)分析，樣品檢測結(jié)果和加標(biāo)回收結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率在96.80-101.30%之間，測試結(jié)果的RSD在0.05-0.28%之間，方法可靠。
結(jié)論
本文建立了一種使用島津 LC-40 液相色譜測定疫苗中苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯防腐劑殘留的方法。實驗結(jié)果表明系統(tǒng)適用性試驗、專屬性、線性、精密度及回收率試驗結(jié)果均滿足檢測要求，并使用該方法對A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物原液樣品進(jìn)行檢測。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于疫苗及生物制品中四種常見的苯酚、間甲酚、2-苯氧乙醇、羥苯甲酯防腐劑的檢測和監(jiān)控。
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
5
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)