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Ramina 應(yīng)用實(shí)例｜實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)性能測(cè)試
前言
拉曼光譜在復(fù)雜水體系中反映組分微小變化的能力深化了該技術(shù)在生物制藥過(guò)程分析（如生物反應(yīng)器中的細(xì)胞生長(zhǎng)）方面的應(yīng)用。拉曼光譜儀技術(shù)可以實(shí)時(shí)、原位和無(wú)損地監(jiān)測(cè)生物制藥生產(chǎn)過(guò)程，可用于復(fù)雜化學(xué)體系的連續(xù)過(guò)程監(jiān)測(cè)。拉曼光譜技術(shù)在生物反應(yīng)過(guò)程中可檢測(cè)大量代謝物變化的能力已將該技術(shù)提升為強(qiáng)大的過(guò)程分析工具。
實(shí)驗(yàn)概述
拉曼光譜分析光學(xué)探頭具有可重復(fù)使用的特點(diǎn)，通過(guò)減少運(yùn)行間的可變性來(lái)提高過(guò)程監(jiān)測(cè)的可重復(fù)性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 過(guò)程分析儀可匹配多個(gè)光纖探頭。MarqMetrix 生物反應(yīng)器球形探頭是專(zhuān)為滿(mǎn)足生物工藝工業(yè)的要求而設(shè)計(jì)的，可以搭載到 Ramina 過(guò)程分析儀上使用。這些探頭具有快速、易于更換和連接以及耐用等特點(diǎn)，可以進(jìn)行無(wú)菌處理，比如離線(xiàn)的高壓滅菌。
DynaDrive 一次性生物反應(yīng)器(S.U.B.)是 S.U.B. 技術(shù)的最新產(chǎn)品，為大規(guī)模生物生產(chǎn)提供了更好的性能，并具備可擴(kuò)展性。與傳統(tǒng)的 S.U.B. 設(shè)計(jì)相比，長(zhǎng)方體的罐體具有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，包括*的混合和傳質(zhì)能力以及更好的可擴(kuò)展性。
本應(yīng)用介紹了Ramina過(guò)程分析儀系統(tǒng)與 500L HyPerforma DynaDrive 生物反應(yīng)器的集成，并實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)(CPPs)的在線(xiàn)測(cè)量，通過(guò)采集整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)生成的光譜數(shù)據(jù)建立起若干參數(shù)和代謝物的精確預(yù)測(cè)模型。
材料與方法
細(xì)胞培養(yǎng)和喂養(yǎng)策略
細(xì)胞培養(yǎng)在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中進(jìn)行（見(jiàn)下圖1），其中包含體積約為320L細(xì)胞培養(yǎng)基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的條件下接種0.5x106個(gè)細(xì)胞/mL。體系的 pH 值通過(guò)添加二氧化碳?xì)怏w和碳酸鈉來(lái)控制。
細(xì)胞在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從第3天開(kāi)始每天進(jìn)行兩步喂養(yǎng)過(guò)程。第一種喂養(yǎng)介質(zhì)以起始體積的重量為4%添加，第二種喂養(yǎng)介質(zhì)以0.4%添加。第6天體系溫度轉(zhuǎn)為33°C。試驗(yàn)在14天后終止。生物反應(yīng)器避光處理以防止雜散光干擾。在高壓滅菌后，將 Ramina 過(guò)程分析儀生物反應(yīng)器球形探頭插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，進(jìn)行在線(xiàn)實(shí)時(shí)拉曼光譜數(shù)據(jù)采集。
圖1.500L Thermo Scientific HyPerforma
DynaDrive S.U.B. 細(xì)胞培養(yǎng)罐
Ramina 過(guò)程分析儀測(cè)試
使用 Ramina 過(guò)程分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（見(jiàn)下圖2）， Ramina 過(guò)程分析儀的生物反應(yīng)器球形探頭直接浸入在生物反應(yīng)器(500L) 中，每平均20次測(cè)量獲取一張拉曼光譜數(shù)據(jù)，積分/曝光時(shí)間為3秒，激光功率設(shè)置為450mW。每個(gè)數(shù)據(jù)光譜的總采集時(shí)間為2分鐘，在 Ramina 過(guò)程分析儀用以建立模型數(shù)據(jù)與離線(xiàn)儀器分析通過(guò)匹配時(shí)間戳以確認(rèn)。
圖2.Thermo Scientific™ Ramina™
在線(xiàn)拉曼分析儀
化學(xué)計(jì)量學(xué)模型建立
來(lái)自多臺(tái) Ramina 過(guò)程分析儀、探頭和生物反應(yīng)器的數(shù)據(jù)被用于創(chuàng)建模型。訓(xùn)練數(shù)據(jù)集從每個(gè)生物反應(yīng)器的45個(gè)樣本中收集，以創(chuàng)建每個(gè)化學(xué)計(jì)量學(xué)模型。對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了檢查，剔除了由宇宙射線(xiàn)引起的異常譜峰。選擇感興趣的光譜區(qū)域，并對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，以去除基線(xiàn)干擾并優(yōu)化信噪比。
建模過(guò)程中測(cè)試了許多預(yù)處理技術(shù)，包括Savitzky Golay濾波、自動(dòng)Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根據(jù)建模的關(guān)注點(diǎn)選擇優(yōu)化不同的預(yù)處理技術(shù)。為每個(gè)感興趣的組分創(chuàng)立偏最小二乘(PLS)模型并進(jìn)行交叉驗(yàn)證以測(cè)試每個(gè)模型的優(yōu)化的效果。這些組分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的常見(jiàn)代謝物。
結(jié)果
在這項(xiàng)工作中，在線(xiàn)拉曼光譜儀應(yīng)用于連續(xù)分批補(bǔ)料 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。使用拉曼光譜監(jiān)測(cè)工藝參數(shù)首先需要使用外部校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集（獨(dú)立離線(xiàn)數(shù)據(jù)）建立化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，通過(guò)對(duì)感興趣的參數(shù)的離線(xiàn)分析數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的在線(xiàn)拉曼光譜數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)關(guān)系建立模型。
為了評(píng)估 Ramina 過(guò)程分析儀預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，每天收集生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析比較。計(jì)算每個(gè)參數(shù)(RMSEP)的校準(zhǔn)均方根誤差(RMSEC)、交叉驗(yàn)證均方根誤差 (RMSECV)和預(yù)測(cè)均方根誤差。根據(jù)模型的預(yù)測(cè)計(jì)算平均誤差，得到用于構(gòu)建模型的 RMSECV。用模型未見(jiàn)過(guò)的“新"數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)試模型，依據(jù)參數(shù)RMSEP判斷。為每個(gè) PLS 模型記錄變異系數(shù) R2。該值用于確定模型預(yù)測(cè)變量（X 變量）可以解釋的 Y 變量的變化量。
值得一提的是，結(jié)合使用來(lái)自同一 CHO 培養(yǎng)過(guò)程的生物反應(yīng)器運(yùn)行的幾個(gè)大型獨(dú)立數(shù)據(jù)集，可以產(chǎn)生更準(zhǔn)確和穩(wěn)健的預(yù)測(cè)化學(xué)計(jì)量學(xué)模型。在這項(xiàng)研究中，來(lái)自之前生物反應(yīng)器運(yùn)行的五個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集被組合起來(lái)訓(xùn)練一個(gè)大型化學(xué)計(jì)量學(xué)模型。然后將校準(zhǔn)模型應(yīng)用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反應(yīng)器的預(yù)測(cè)。數(shù)據(jù)表明該模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)這個(gè)新數(shù)據(jù)集，并且模型預(yù)測(cè)與離線(xiàn)收集的眾多代謝物的數(shù)據(jù)測(cè)量高度相關(guān)，如下表1所示。
表1.模型預(yù)測(cè)值與離線(xiàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性
下圖為賽默飛Hyperforma DynaDrive S.U.B.化學(xué)計(jì)量學(xué)模型預(yù)測(cè)——各重要參數(shù)的拉曼預(yù)測(cè)模型和離線(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比。
結(jié)論
可重復(fù)使用MarqMetrix生物反應(yīng)器BallProbe 探頭具有TouchRaman浸沒(méi)技術(shù)，連接Ramina過(guò)程分析儀，可對(duì)500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及總細(xì)胞密度和活細(xì)胞密度進(jìn)行準(zhǔn)確的在線(xiàn)實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)。相關(guān)性分析顯示模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與離線(xiàn)分析數(shù)據(jù)之間具有良好的一致性，表明模型能穩(wěn)健地應(yīng)用于上表1中所示參數(shù)的預(yù)測(cè)。