方法一

[試劑準(zhǔn)備]

A液： 1M ， MnCl₂ ：

B液： 1M ， HEPES ， pH=6.2-6.8 ，用無(wú)菌水配，配后不需滅菌；

C液 稱取 CaCl₂ 0.10g ， KCl 1.18g ，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入 46ml 三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋 121 ℃高壓滅菌備用。

[操作方法]

1. 取 1 管 B 液（ 0.6ml ），全部加入 C 液 （46ml） 中，混勻后，再用 1ml 移液器加入 3.3ml A 液，混勻冰浴即可使用。

2. 劃線得到單菌落，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約 17 小時(shí)， 挑取 2-4 個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有 100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶 ,37 ℃劇烈振蕩（ 300 rpms ）培養(yǎng) 3-4 小時(shí)，將培養(yǎng)溫度調(diào)至 18℃ 劇烈振蕩（ 3280 rpms ）培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入 4ml TB 緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入 280ml DMSO （可用國(guó)產(chǎn)分析純），混勻后分裝入 1.5ml EP 管，冰上靜置 15 分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的 EP 管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置 12 小時(shí)以上。取出感受態(tài)放入 -70℃ 超低溫冰箱備用。

此法效率非常高，一般可到 10⁸ ，好時(shí)可到 10⁹ ，特別適宜于大片段與文庫(kù)構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。

關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，zui復(fù)雜的莫過于電轉(zhuǎn)化，而zui簡(jiǎn)單的則是將 LB 平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的 EP 管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。

現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率zui高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到 10¹⁰ ，但是操作起來比較麻煩。要想又簡(jiǎn)單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，的莫過于 1990 年《gene》上刊登的由 Inoue H. 等提出的感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。

[注意事項(xiàng)]

1 、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。離心力要注意不要超過 2500g，建議 1500-2000g 5min 。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴 2 小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干（ 20-30 分鐘）這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。

2. 預(yù)冷是必要的。整個(gè)過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置 1min ，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助，*次多加一點(diǎn)緩沖液。

3. 培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過程中的能量代謝問題，是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積 / 三角瓶容量 =100ml/500ml ， 50ml/250ml 。

4. 培養(yǎng)基的 pH 值。這是講的 pH 值并非單指配置或滅菌后的 pH 值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的 pH 值。一般來說，接種前的 pH 值在 6.8-7.2 ，等菌搖好后，可以測(cè)一下 pH 值，不要低于 6.0 ，在 6.5 以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。

5. 培養(yǎng)后的 OD 值。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng) OD 值大到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào) OD 不得大于 0.6， 0.8 等等。同時(shí)， OD 值大時(shí)菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點(diǎn)，因而需要在 OD 值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。

6. 培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的 Mg²⁺ 離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用 20mM MgCl2 做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前 20-30 分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。

7. 培養(yǎng)溫度。較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了 Inoue 的感受態(tài)制備方法，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。

8. 此外文獻(xiàn)報(bào)道，在保存感受態(tài)時(shí)， DMSO 要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。

9. 液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。

方法二

1. 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌 *E.COLI DH5，JM109，HB101 等，在 LB 平板上劃線，37 度過夜至長(zhǎng)出單菌落。

2. 挑直徑 1-3 毫米的單菌落 * 可多個(gè)，接種到 250 毫升 /3 升錐形瓶 或 80 毫升 /1 升錐形瓶的 SOB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量不可再多, 會(huì)影響效率。

3. 在 18 度 150-250RPM 培養(yǎng) 19-50 小時(shí) * 沒有冷卻搖床的可在室溫 , 但不可高于 37 度 .

4. OD600 約 0.4-0.8 時(shí)停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻 10 分鐘

5. 4 度，300RPM 離心