凱基細(xì)胞凋亡DNA Ladder檢測試劑盒
（ApotosisDNA Ladder Detection Kit）
Cat number：KGA For Research Use Only
Store at-20℃ for one year
Expire date：
一、試劑盒說明
細(xì)胞核染色質(zhì)DNA斷裂是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志特征。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核酸內(nèi)切酶被激活，選擇性降解染色質(zhì)DNA，形成50-300 kb的大片段，并進(jìn)而在核小體連接處斷裂，形成180-200 bp或其整倍數(shù)的DNA片段，這些DNA片段可從細(xì)胞中提取出來，通過瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色呈現(xiàn)為梯狀條帶（DNA Ladder），并據(jù)此判斷細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。凱基細(xì)胞凋亡DNA Ladder檢測試劑盒提供了一種簡便、快速地提取染色質(zhì)DNA的方法，并增加對小片段DNA的回收，從而增強(qiáng)了檢測的敏感性。
本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測（不*用于檢測組織樣本）。
二、試劑盒組份
| 組份 | Cat:KGA111（20 assays） | Cat:KGA112（50 assays） | Cat:KGA113（100 assays） | 儲存條件 |
| Lysis Buffer | 4 mL | 10 mL | 20 mL | 4℃ |
| Solution A | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -4℃ |
| Enzyme A | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -20℃ |
| Enzyme B | 400μL | 1.0 mL | 2.0 mL | -20℃ |
| Precipitant | 3.0 mL | 6.5 mL | 13.0 mL | 4℃ |
| Loading Buffer | 80μL | 0.2 mL | 0.4 mL | 4℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
高速離心機(jī)、微量移液器、渦旋振蕩器、凝膠電泳儀、37-55℃水浴
1.5m L Microtube、PBS、胰酶消化液、冰乙醇、TE Buffer，瓊脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker
四、使用注意事項(xiàng)
1. DNA Ladder出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡晚期，觀察細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生皺縮出芽，染色質(zhì)*凝聚，細(xì)胞核已固縮斷裂的凋亡晚期形態(tài)，建議該種形態(tài)的凋亡細(xì)胞比例在30%以上時(shí)進(jìn)行DNA Ladder檢測或*行Tunel檢測，
2. DNA Ladder出現(xiàn)在一個(gè)較短的時(shí)間段，在凋亡早期取樣，則無DNA降解的條, 帶，而在凋亡末期取樣則產(chǎn)生與細(xì)胞壞死相似的DNA彌散條芾。因此取樣時(shí)間需根椐不同種類的細(xì)胞和誘導(dǎo)劑而摸索確定。
3. 貼壁細(xì)胞不用胰酶消化而用細(xì)胞刮收集。
4. 某些細(xì)胞不產(chǎn)生這種核小體間的DNA斷裂，而是產(chǎn)生50-300kb的大片段斷裂。
五、操作方法
1． 離心收集105~106細(xì)胞（1500×g，離心5min）于1.5mL微量離心管中；
2． 用PBS洗滌細(xì)胞二次（1500×g，離心5min），棄上清；
3． 沉淀的細(xì)胞中加入100μL Lysis Buffer，渦旋振蕩器上劇烈混合10秒， 1000×g，離心5min后移上清于另一1.5mL微量離心管中；
4． 沉淀再加入100μL Lysis Buffer重復(fù)上步，合并兩次的上清液；
5． 在上述合并的上清液中加入20μL Solution A，再加入20μL Enzyme A， 55℃反應(yīng)1小時(shí)；
6． 加入20μL Enzyme B,37℃孵育1小時(shí)；
7． 加入130μL Precipitant和950μL冰乙醇, 混勻，置—20℃,1小時(shí)以上或過夜；
8． 4℃，12，000-14，000 rpm離心15-30min，小心地棄去上清，收集沉淀的DNA；
9． 加入0.5mL 70%的冷乙醇，洗DNA沉淀，再12，000-14，000 rpm離心20min；
10．棄上清，DNA沉淀于室溫干燥10 min后，加入10-15μL TE Buffer，充分?jǐn)嚢枞芙?/span>DNA；
11．取上述10-15μL樣品加入2-3μL Loading Buffer， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠和電泳緩沖液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶）；
12．5V/cm電泳1小時(shí)，紫外燈下觀察并拍照。
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