下面的表格概括了細胞離心分離純化主要方法：（文獻1）

 

公式中 d 為細胞直徑（cm）

σ為細胞密度（克/cm³） η為介質粘性系數(shù)

ρ為梯度介質密度（克/cm³） ω為轉頭旋轉角速度

r 為細胞所在位置與旋轉中心的距離（cm）

ⅰ. 差分離心：

在不存在密度梯度條件下分離細胞是這種方法的主要特點，差分離心可以是利用地球重力（1g），也可以是利用低速離心分離組織勻漿。在重力或離心力作用下一些比較大的細胞沉降速度較快，當它們已變成沉淀時，大部分比較小的的細胞由于沉降速度慢而仍留在上清液中。很明顯在大的細胞變成沉淀時一部分接近離心管底的較小細胞在離心力也已變成沉淀，*次離心可以使zui大顆粒細胞全部沉淀但沉淀中少量的較小細胞降低了分辨率和純度。我們可以用*次離心同樣轉速和時間將*次沉淀稀釋后再離心（每次都要用同樣的緩沖液稀釋）（這叫在離心機中“洗”），重復數(shù)次可以得到較純的大顆粒沉淀。各次上清液合并以更高轉速離心，重復以上過程數(shù)次，就可以得到各種較純的不同大小的顆粒的沉淀。如果利用某些特殊梯度材料（如dextran percoll （,）可以用 （, ）小的離心次數(shù)得到較好的結果。（文獻4）。

ⅱ. 依賴重力加速度沉降：

不用離心機，將細胞懸液鋪在預形成密度梯度上表面，在重力作用下細胞沉降。一般設計的密度梯度采用較小的密度變化范圍，其zui大密度小于密度zui大的細胞密度。不同密度的細胞以很慢的速度按不同層次沉降。在zui大密度細胞達到底部之前進行分部收集。（收集的方法參照“離心技術講座”文章3a）

ⅲ. 利用速率－區(qū)帶密度梯度離心法分離細胞：

在本質上與重力沉降是一樣的，但是利用離心場來減少分離的時間。小容量樣品用甩平轉頭，大容量樣品用區(qū)帶轉頭，對于較少數(shù)量的細胞（10⁶ ～10⁸），并且不同細胞的沉降速度有較大差異，用甩平轉頭離心分離可以得到很滿意的結果。對于較大數(shù)量的細胞（＞10⁹）可以考慮利用區(qū)帶轉頭。區(qū)帶轉頭操作是離心技術中比較復什的分離工藝，需要較熟練的操作人員，細心的工作才能得到成功。由于在區(qū)帶轉頭中離心分離不存在用離心管分離時產(chǎn)生的壁部效應（Wall effect）參考加離心技術講座文獻3），可以一次離心收獲大量比較純的細胞。

曾有人在甩平轉頭的吊桶中加特殊的適配器（套管）來分離純化少量的細胞（＞5 ×10⁷），提高了分離的純度（文獻5）。

如果不同細胞間尺寸差別不大，在離心場中沉降速度差別不大；或者需要制備大量的細胞用這個方法就不太合適。

iv.   離心浮選

利用一個特別的錐形轉頭，錐頭方向與離心力方向相同，樣品從錐頭進入，利用離心力在圓錐形離心管中對細胞產(chǎn)生的逆流效應，可以有效地分離各種細胞（如各種培養(yǎng)細胞，酵母細胞，各種血細胞，受精卵等等）離心浮選轉頭一般配備在低速或高速低溫離心機中（如Hitachi 的R5E 離心浮選裝置，Beckman 的JE-6B 離心浮選系統(tǒng)）由于樣品是從圓錐頭部壓入，每種細胞都受到離心力和由于錐度形成的流速梯度產(chǎn)生的反向力，不同形狀、尺寸、不同密度的細胞在錐形離心室中不同位置達到力的平衡從而形成不同種類細胞的區(qū)帶，按順序從錐室大頭排出。

l 不需要制備密度梯度；

l  可以分離10⁷ ～10⁹ 個細胞；

l  zui使用于分離平均尺寸為2μm~50μm 的細胞；

l  由于錐形離心管用透明材料制成，在離心室門蓋上可以安裝透明窗用于觀察分離情況并可以裝置攝像機通過屏幕觀察分離過程；

l  加樣泵有較大的流量1～120 毫升/分，可以在很短時間內(nèi)用較低的轉速（zui高

不超過5,000rpm）成功分離各種細胞；

l  不損傷細胞；

l  很高的分辨率；

l  設備投資很高，操作者需培訓積累操作經(jīng)驗。因此應用受到很大限制。

 

3. 用于細胞分離的密度梯度

在講座3 中已較詳盡地敘述了密度梯度材料，梯度形狀，梯度離心等問題，對于細

胞離心分離，對密度梯度材料還有一些特別重要的提示：

 l  對細胞無毒性；

l  可以配制等滲液；

l  不會滲入細胞內(nèi)部；

l  離心后作分部收集，易從收集液中除去分離介質（如透析）；

l  較低的粘性系數(shù)。

用于細胞分離的梯度材料是：Percoll, Nycodenz, Ficoll, metrizamide 和小牛血清白蛋白。它們的性質已在講座文獻的（3），（3）a，（18）中已說明。

細胞分離常用的梯度可以是線性的，非線性的（凸指數(shù)或凹指數(shù)）連續(xù)的或不連續(xù)的，梯度制備方法參考講座文獻3（a）。

需要指出的是細胞離心配置的梯度液必須是等滲的，沿整個離心管長度方向滲透壓變化要小于10％，也就是說細胞在沉降過程中收縮和膨脹都非常小，它們的基本性狀和離心分離前基本一致。梯度材料研制和生產(chǎn)廠對于配制各種等滲液都提供了詳細資料。（講座文獻18）

 

4. 細胞離心分離過程中常常遇到的一些問題

i. 細胞聚集：

細胞聚集后在離心過程中的沉降行為與單個細胞*不同，因此出現(xiàn)細胞聚集會影響分離純度。避免的方法是添加一些防止粘結的成分如小牛血清白蛋白，脫氧核糖核酸酶（D Nase ，防止膠結）、蛋白酶（protease ）、EDTA 等；（參考文獻6）

關于離心分離溫度，有些論文設在4℃離心分離細胞效果很好，也有人認為初步分離時溫度應保持在20℃以上。（文獻7）

ii.   在梯度液中細胞過載：

在密度梯度離心中，每種細胞的數(shù)量都不能超過對應于它的密度的梯度液的容量， 也就是每種細胞在梯度液中所占有的梯度層的厚度是受限制的，過分厚的純樣品區(qū)帶會與別的細胞的純樣品區(qū)帶相重疊；這是問題的一方面。另一方面，雖然垂直管轉頭在高速離心時，它的離心管縱切面可以容納更多的樣品分子（與甩平轉頭的離心管橫剖面相比較），但在離心完成、梯度從垂直方向轉換到水平方向后，每個純樣品所占據(jù)的離心管中心軸上的寬度很大。如果初始樣品中所含的細胞品種很多，純化后也會造成純樣品帶的重疊。關于這個問題沒有的數(shù)學計算，全靠用戶在實驗中逐漸積累經(jīng)驗。這涉及待分離樣品中細胞的濃度，和梯度離心時的加樣量（2％～5％離心管容量）以及梯度的形狀（梯度曲線的斜率，連續(xù)梯度或者階梯梯度）等等。

iii.    壁部效應：

在角式轉頭中沿離心力方向沉降的細胞接近離心管壁部時，與在離心力分力作用下沿管壁下滑的細胞碰撞，造成在角式轉頭離心管近外壁部形成了一個“壁部效應區(qū)”，這個壁部效應區(qū)從離心管上部到下部逐漸加寬。由于壁部效應，可能會造成部分細胞的聚集而影響分離純度，也可能有一小部分細胞由于碰撞而受損。這種影響在用固定角式轉頭作等密度離心時尤為顯著。所以細胞離心分離除浮選轉頭外一般小容量選擇甩平轉頭，大容量選擇區(qū)帶轉頭。

iv.    旋渦效應：

在加速或減速過程中在離心管中產(chǎn)生的小旋渦會影響梯度的完整，在減速過程中還會影響已被分離的純樣品帶的寬度，轉速500rpm～1000rpm 之間往往在復合向心力、也就是Coriolis 力的作用下在離心管中會產(chǎn)生渦旋，渦旋在下列情況下可以減少：

l  增加回轉半徑；

l  慢加速和慢減速（根據(jù)不同轉頭，不同容量，不同離心方法可以多檔控制的加、減速速率）；
l  縮小離心管直徑（∮10mm 以下，這在大多數(shù)情況下不現(xiàn)實）；
l  使用一些抗旋渦的緩沖液（文獻5）；
l  應用有較陡斜率的密度梯度。

 

v.    液滴效應：

在預形成密度梯度液上表面加待分離的細胞樣品，如果不馬上離心，就會有很少的液滴滴入梯度層。這個現(xiàn)象在加樣后幾分鐘內(nèi)會發(fā)生，其結果是在樣品與梯度液的界面上出現(xiàn)層間擴散（文獻8）而影響分離效果，減少這種影響的方法是

l  降低樣品濃度；

l  提高梯度液的初始斜率；

l  在鋪完樣品后立即放入轉頭并開始離心分離。

vi. 離心力的選擇：

離心力選擇不當會影響細胞活力改變、細胞的內(nèi)部構造、影響細胞的裂介和復制。這種影響常出現(xiàn)在：

l  長時間的離心分離過程；

l  轉頭的快加速；

l  過大的離心力產(chǎn)生了較大的流體靜壓；

l  應用較高轉速的等密度離心法。

如果我們選用較低的轉速，粘度較小的梯度材料（本講座文獻18）；利用細胞浮選轉頭等都可以減少這種影響。

vii． 滲透效應：

很多細胞特別是哺乳動物細胞沒有堅固的細胞壁，周圍的介質很容易滲透到細胞內(nèi)部或者細胞內(nèi)液體反向滲透到周圍介質中而引起細胞的膨脹和收縮，從而改變離心過程中細胞的沉降（或上?。┨匦?。因此配制等滲的梯度液是必要的（講座文獻18）

 

（1） 血細胞純化：

血細胞由多種類型的但細胞懸液組成，每種細胞都有它們自身的特性和功能并廣泛被用于醫(yī)學臨床和診斷。多年來研究人員對血細胞分離純化作了大量工作，實驗室研究和血液成分分離都已廣泛使用各種離心設備，如用于醫(yī)學臨床分析、診斷的全自動血細胞洗滌離心機（Hitachi MC-450,24 管，Sorvall CW-2,12 管），用于大量血液（標準200ml，300ml，400ml,500ml 三聯(lián)或四聯(lián)血袋）成分分離用的大容量低速、低溫離心機（參考技術講座文獻1）等等。下面我們將以實驗室研究為主線，舉例說明各種血細胞分離純化方法。

由B∮yum 研發(fā)并在多年來被普遍應用的血細胞純化方法是用梯度材料Na-metrizaate 與Ficoll 的混合液作密度梯度離心，把血球中的紅血球，多形核細胞、淋巴細胞、單核細胞、血小板分離純化。這種溶液有不同的商品名稱如Lymphoprep（Nycomed Pharma 公司）、Ficoll －pague （pharmacia-Biosystems 公司）等，都可以作這一用途。（文獻9）

 

例1．人血中單核（白）細胞的純化

 

例2. 從人血中分離紅細胞，單核（白）細胞，中性（白）細胞

i. 新鮮人血（3～5）ml 用抗凝劑處理。

ii.  15ml 離心管中先注入5ml 分離液Polymorphprep（Nycomed Pharma A/S 公司產(chǎn)品）， 然后鋪上用抗血凝劑處理過的人全血5ml 。

iii. 臺式低速離心機，甩平轉頭，450g（1500～1600rpm）×35 分鐘，18℃～23℃。

iv. 分離結果：離心管上部近40％液柱為血漿，接下來一薄層為單核細胞再下面間隔了少量分離液后又是一薄層中性（白）細胞，再往下近30％液柱為分離液，紅細胞在底部（沉淀）。

注意：溫度過高，或離心力過大，或離心時間過長都可能使中性（白）細胞沉淀。

表：用于人血細胞分離純化的各種商品分離液（摘自文獻1）

 

 

參考文獻：

1 ：“Bruwer，A“等“Centrifugal Separations of mammalian calls”in“Centrifugation-a Practical
approach”PP271～314 OXFORD Uni.press，1992.
2：“B∮yun , A.”“Scand. J. Clin. Inrest. Vol. 21 （Suppl. 97） P. 77”
3：Wisse，E.等“Progress in liver diseases”Vol：Ⅵ P153，Grune and Stratton，Inc.1979）
4：“B∮yun , A. 等” “Iodinated density gradient media：a practical approach, Oxford Uni.IRL Press 1984
5：Tulp.A. 等 Anal.Biochem.Vol.117 P354 （1981）
 6：Brouwer,A 等人“Sinusoidal liver cells” P509，Elsevier Biomedical press .Amsterdam, 1982
7：Pertoft, H 等“Cell Separation：methods and selected applications”Vol 1，P41 Academic press. New York 1982

8：Remenyik，C.J. 等Arch. Biochem. Biophys.Vol:201 P500

9：B∮yun , A.“Scand .J.Clin.Invest.Vd:21, P77

10：Knook, D. L. 等“Exp. Cell Res. Vol:99, P444

11：MacGlashan, D.W 等“Cell Separation：Methods and Selected application ”Vol：1 P301 Academic Press. New York 1982

12：Wells, J.R. 同上書P169

13：Bezooijen C.F.A 等“Pharmacological morphological and Phisiological Aspects of liver aging” Vol:1 P115（1984）

14：Knock，D,L 等“Exp 。Cell Res. Vol:139 P468 （1982）

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