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上海恒遠(yuǎn)技術(shù)人員與您一起探討正確提取植物組織蛋白質(zhì)方法
閱讀：969 發(fā)布時(shí)間：2014-6-27一、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
1. sample,液氮研磨
2. 裝1.5 ml centrifuge 用tube
3. 加 1 M KH2PO4+K2HPO4 700 μl
4. 12000 rpm,4度,10-15minite
5. 取上層液，蛋白質(zhì)就在里面
二、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。100 mg材料剪碎后加入10 mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% （丙酮配制，含10 mM即0.07% β-巰基乙醇），混勻，-20 ℃沉淀1小時(shí)，4 ℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5 ml冷丙酮（含10 mM β-巰基乙醇），再于-20 ℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。按每mg干粉加入20 μl（可調(diào)）UKS液[9.5 M尿素，5 mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫蘇糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37 ℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好!上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存。
三、組織：腸黏膜
目的：WESTERN BLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5 ml每1 mlTRIPURE用量）倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10 min 離心：12000 g，10 min，4度，棄上清加入0.3 M鹽酸胍/95%乙醇：（2 ml每1 mlTRIPURE用量）振蕩，置室溫20 min 離心： 7500 g，5 min，4度，棄上清重復(fù)0.3 M鹽酸胍/95%乙醇步2次沉淀中加入*乙醇 2 ml 充分振蕩混勻，置室溫20 min 離心： 7500 g，5 min，4度，棄上清吹干沉淀 1%SDS溶解沉淀離心：10000 g，10 min，4度取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的問題：加入1%SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶測(cè)濃度，含量才1 mg/ml左右。解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5-10分鐘，效果很好的。
四、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 三氯醋酸—丙酮沉淀法
1. 在液氮中研磨葉片
2. 加入樣品體積3倍的提取液在-20 ℃的條件下放置一晚，然后離心（4 ℃ 8000 rpm以上1小時(shí)）棄上清。
3. 加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4 ℃ 8000 rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。
4. 上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15 ℃ 8000 rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4 ℃待用。
5. 用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80 ℃?zhèn)溆谩Ｋ幤罚禾崛∫海汉?0%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7 g尿素0.2 g CHAPS溶于3 ml滅菌的去離子水中（終體積為5 ml），使用前再加入1 M的DTT65 μl/ml。這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)!當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少!
五、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
1. 200毫克樣品置于冰上磨碎
2. 加lysis buffer，離心，10000 rpm，4度，5 min取上清
3. 重復(fù)離心5 min
4. lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
六、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
1. 根據(jù)樣品重量（1 g樣品加入3.5 ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2. 把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。
3. 用離心機(jī)離心8000 rpm 40 min 4 ℃或11100 rpm 20 min 4 ℃
4. 提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質(zhì)提取液：300 ml
（1）1 M tris-HCl（pH 8）45 ml
（2）咁油（Glycerol）75 ml
（3）聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone） 6 g 這種方法針對(duì)SDS-Page，垂直板電泳