貨號：YC1131                                                 規(guī)格：100管/96樣

糖原含量試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

糖原是由葡萄糖單位構(gòu)成的高分子多糖，是糖的主要的儲存形式之一，主要貯存在肝和肌肉中作為備用能量，分別稱為肝糖原和肌糖原。肝糖原可調(diào)節(jié)血糖濃度，當(dāng)血糖升高時可在肝臟合成糖原，血糖降低時，肝糖原則分解為葡萄糖以補(bǔ)充血糖。因此，肝糖原對維持血糖的相對平衡十分重要。肌糖原是肌肉中糖的儲存形式,在劇烈運(yùn)動消耗大量血糖時，肌糖原不能直接分解成血糖，必須先分解產(chǎn)生乳酸,隨血液循環(huán)到肝臟,通過糖異生轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚱咸烟恰?/span>

測定原理：

蒽酮法。利用強(qiáng)堿性提取液提取糖原，在強(qiáng)酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、濃硫酸（不允許快遞）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：0.1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶， 4℃保存；

糖原提?。?/span>

1﹑細(xì)胞或細(xì)菌：收集500~1000萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；加入0.75mL提取液超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；轉(zhuǎn)移至10mL試管中，95℃水浴20min（蓋緊，防止水分散失），隔5min振搖試管1次，使充分混勻；取出試管冷卻后，用蒸餾水定容到5ml，混勻，8000g 25℃離心10min，取上清液待測。

2﹑組織：稱取0.1~0.2g樣品，加入0.75ml 提取液充分勻漿；轉(zhuǎn)移至10ml試管中；95℃水浴 20min（蓋緊，防止水分散失），隔5min振搖試管1次，使充分混勻；待組織全部溶解后，取出試管冷卻后，用蒸餾水定容到5ml，混勻，8000g 25℃離心10min，取上清液待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95℃。

3、試劑二工作液的配制：在試劑二中倒入6mL蒸餾水，緩慢倒入24mL濃硫酸，充分溶解混勻后使用；用不完的試劑4℃保存一周；

4、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)） ：

混勻，置95℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96孔板中，于620nm波長處，分別讀取空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光度，分別記為 A1、A2 和 A3。

注意：1、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要測一次。

2、如果 A3-A1大于2，需要將樣本用蒸餾水稀釋，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

糖原含量的計算：

1、按照樣本質(zhì)量計算

糖原（mg/g 鮮重）＝1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

= 0.555×(A3-A1)÷（A2-A1)÷W

2、按照蛋白質(zhì)含量計算

糖原(mg/mg prot)＝1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷(V1×Cpr)

=0.111×(A3-A1) ÷（A2-A1) ÷Cpr

1.11：是此法測得葡萄糖含量換算為糖原含量的常數(shù)，即 111ug 糖原用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于100ug 葡萄糖用蒽酮所試劑顯示的顏色；C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1mg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中待測樣本體積，0.06mL；V2：加入提取液體積，5mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

注意：低檢測限為 10ng/g  鮮重或 0.1ng/ mg prot 。

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