實(shí)驗(yàn)原理

CCK-8 (Cell Counting kit-8)試劑中含有WST-8:化學(xué)名: 2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基.苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸.二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臌產(chǎn)物(Formazan)， 生成的甲贊物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，可采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

常見問題FAQ

Q: CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖和毒性的優(yōu)點(diǎn)有哪些?

A: A: CCK- 8較傳統(tǒng)的MTT法優(yōu)點(diǎn)在于

1) MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解而CCK- 8產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟，

2)CCK-8檢測靈敏度更高，更加穩(wěn)定;

3)酚紅和血清對其測定無明顯影響;

4)不必去上清，不必洗,滌細(xì)胞更加簡便;

5)對細(xì)胞無明顯毒性，加入顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板使檢測時(shí)間更加靈活，而且不影響細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Q :在做細(xì)胞的加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對CCK-8測定是否有影響?如何解決?

A: 1)注意如果藥物具有還原性(如維生素C)，會和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng)增加吸光度。

2)藥物中的金屬對CCK-8顯色有影響:當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%, 90%的顯色反應(yīng)使靈敏度降級。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。解決辦法:首先要確認(rèn)藥物是否有吸收,在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

3) 由于培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實(shí)驗(yàn)之前建議使用一個(gè)孔作一 下檢測，有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。-般正常的0D值應(yīng)該在0.4以下。

Q: CCK-8如何設(shè)定空白對照?

A :在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8.培養(yǎng)-定的時(shí)間，測定450nm的吸光度即為空白對照。 在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收可在不含細(xì)胞.加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)-定的時(shí)間，測定450nm的吸光度作為空白對照。

Q: CCK-8對于不同的細(xì)胞，靈敏度是否-樣?

A:不一樣,懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難染色。對于貼壁細(xì)胞,一般加入CCK 8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

Q :可否采用CCK-8法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)?

A :可以，以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板通過計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)孔板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量反映細(xì)胞的黏附性。細(xì)胞的黏附性越強(qiáng)，則單位時(shí)間內(nèi)貼于鋪有L n板底的細(xì)胞數(shù)量越多去除尚末貼壁的細(xì)胞后,應(yīng)用CCK-8等方法計(jì)量細(xì)胞數(shù)量便可間接反映不同細(xì)胞或不同處理的細(xì)胞黏附能力的差異。

Q :可否采用CCK-8法進(jìn)行藥物的IC50檢測?

A :可以，將細(xì)胞培養(yǎng)后按照不同濃度的藥物處理定時(shí)間后進(jìn)行CCK-8檢測，根據(jù)吸光度繪制曲線，計(jì)算該藥物抑制細(xì)胞數(shù)量一半時(shí)的濃度(IC50)。

參考文獻(xiàn)

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as achromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997.44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicitywith a ，highlywater-soluble tetrazolium salt,neutral red andcrystal violet.Biol Pharm Bull1996, 19(11):1518-1520.

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