SILAC代謝標記定量實驗服務(wù)

實驗技術(shù)簡介: SIL AC的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細胞經(jīng)5-6個倍增周期后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸*摻入到細胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級質(zhì)譜圖中兩個同位 素型肽段的面積比較進行相對定量。屬于體內(nèi)代謝標記法。

實驗操作流程:

1、蛋白提取和樣品制備

2、標記效率測試

3、樣品混臺

4、SDS-PAGE分級

5、酶解

6、質(zhì)譜鑒定

7、軟件分析

8、定性定量蛋白質(zhì)組結(jié)果

9、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘和統(tǒng)計分析

實驗注意事項:

客戶提供:

1、蛋白質(zhì)提取物:濃度>1μg/ul, 蛋白質(zhì)總量>300μg.

2、細胞:通過細胞計數(shù)取不少于2x106個細胞于EP管，加入0 5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱(-80°C， 避免反復(fù)凍融)。

交付標準:

1、蛋白質(zhì)鑒定和SIL AC定量分析結(jié)果;

2、客戶蛋白質(zhì)對應(yīng)的質(zhì)譜峰圖;

3、SIL AC實驗完整的實驗步驟、使用儀器、軟件檢索參數(shù)等。

其他:

1、SILAC是體內(nèi)標記技術(shù)，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸與天然氨基酸化學(xué)性質(zhì)基本相同，所標記的細胞和未標記細胞在生物學(xué)行為上幾乎沒有差異，標記效率可高達100%。

2、采用質(zhì)譜定量,定量結(jié)果準確且批次變異小、重復(fù)性好。

3、體內(nèi)代謝標記與SDS- PAGE或色譜分離技術(shù)相結(jié)合，兼容疏水性蛋白和偏堿性蛋白，不受蛋白性質(zhì)限制。

4、多個樣品混合后同時進行分離、酶切和鑒定,后續(xù)實驗對樣品的影響一致， 減少了實驗操作和儀器設(shè)備產(chǎn)生的影響。

5、由于該技術(shù)屬于體內(nèi)標記，標記效果穩(wěn)定，其標記效率不受裂解液的影響，不僅適合于進行全細胞蛋白的分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量。

6、與化學(xué)標記相比，SIL AC方法蛋白需要量明顯減少，通常每個樣品只需要幾十微克的蛋白量。

7、活體標記，更接近樣品真實狀態(tài)。

8、只適用于活體培養(yǎng)的細胞，對于生物醫(yī)學(xué)研究中常用的組織樣品，體液樣品等無法分析,對于動物模型的標記成本太大，無法實現(xiàn)。與體外標記技術(shù)相比，SIL AC屬于體內(nèi)標記，具有以下技術(shù)優(yōu)勢

1、高通量，可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì);

2、定量精確，降低由于樣品制備不同而造成的實驗差異;

3、線性定量范圍廣;

4、靈敏度更高，蛋白質(zhì)需要量明顯減少;

5、標記采用的是體內(nèi)標記技術(shù)，更接近樣品真實狀態(tài)。

SILAC技術(shù)服務(wù)內(nèi)容

1、細胞同位素標記;

3、SDS-PAGE分離;

4、胰酶酶切后液相分離和質(zhì)譜分析;

5、數(shù)據(jù)庫檢索及蛋白質(zhì)定量分析;

6、差異蛋白的生物信息學(xué)分析;

7、實驗報告提交。

實驗服務(wù)報告內(nèi)容

1、蛋白定鑒定和SIL AC定量分析結(jié)果;

2、顧客蛋白質(zhì)對應(yīng)的質(zhì)譜峰圖;

3、SIL AC實驗完整的實驗步驟、使用儀器、軟件檢索參數(shù)等。

技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢

1、靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白;

2、分離能力強，分析范圍廣，iITRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進行分離鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸

性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白;

3、高通量:同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質(zhì)進行分析;

4、結(jié)果可靠:定性與定量分析結(jié)果更加可靠;

5、自動化程度高:液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。

實驗代做服務(wù)：