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還原性谷胱甘肽GSH檢測(cè)方法推薦
閱讀：743 發(fā)布時(shí)間：2016-3-16| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 47KB |
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Beutler改良法測(cè)定組織GSH操作規(guī)程
- 原理及意義
原理：DTNB能被-SH基團(tuán)還原，產(chǎn)生等克分子的2-硝基-5-巰基苯甲酸，而苯甲酸陰離子在一定PH值條件下呈黃色，在412 nm波長(zhǎng)下有吸收峰。
意義：還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一種低分子自由基清除劑，它可清除O2˙ 、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種小分子肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，并且是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）兩種酶類(lèi)的底物，為這二種酶分解氫過(guò)氧化物所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷，zui近還證明GSH也參與使Vit E恢復(fù)到還原態(tài)的作用。GSH測(cè)定值的高低可間接反映機(jī)體發(fā)生氧化損傷的程度。
- 器材
可見(jiàn)光分光計(jì)、7 ml離心管和管架、加樣器和槍頭
- 試劑
① 1 mmol/L的GSH（標(biāo)準(zhǔn)品）；
② 1％檸檬酸鈉；
③ 二硫雙基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）試劑：用1％檸檬酸鈉配成終濃度0.04％（w/v）；
④ 20％三氯醋酸；
⑤ 0.3 mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）緩沖液。
- 步驟
1、樣品處理及試驗(yàn)步驟（下面以肝臟組織為例）
稱(chēng)取一定量的肝臟組織于冰冷0.85％生理鹽水中漂洗，濾紙吸干表面水分，燒杯內(nèi)剪碎 制備20%組織勻漿液（須用0.85％生理鹽水或三蒸水） 4000 g離心10 min后取上清液 按上清液:20％三氯醋酸（體積比）為2:1混合（加TCA前留取20 μl上清液用于Lowry法測(cè)蛋白） 混勻，4000 g離心10 min（此步離心要充分，可適當(dāng)提高離心力） 收集上清液按表2測(cè)定。
2、按下表1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（單位：ml）
表1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定
GSH（μmol/L） | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
1 mmol/L的GSH | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 |
三蒸水 | 0.5 | 0.45 | 0.4 | 0.35 | 0.3 | 0.25 |
磷酸鹽緩沖液 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
DTNB試劑 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混勻，5 min內(nèi)于412nm比色，以三蒸水調(diào)零，以標(biāo)準(zhǔn)GSH濃度為X軸，相應(yīng)吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并求回歸方程。
3、按下表2操作測(cè)定樣品GSH（單位：ml）
表2 Beutler改良法樣品測(cè)定操作
試 劑 | 測(cè)定管 | 空白管 |
待測(cè)樣品液 | 0.1 | 0 |
磷酸鹽緩沖液 | 4.4 | 4.4 |
DTNB試劑 | 0.5 | 0.5 |
三蒸水 | 0 | 0.1 |
測(cè)得的吸光值代入回歸方程，可計(jì)算出樣品液的GSH濃度。
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果
GSH濃度（μmol） | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 |
A值 | 0.000 | 0.126 | 0.260 | 0.394 | 0.529 | 0.666 |
根據(jù)上數(shù)據(jù)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：
X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y為吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)看Figure 1）
Figure 1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖
- 注意事項(xiàng)
- 樣品應(yīng)冰上勻漿，所有步驟盡量保證低溫下操作，否則結(jié)果偏低；
- 所有用水均需三蒸水，否則結(jié)果偏低；
- 未經(jīng)蛋白變性處理的樣品在－20℃不宜存放；
- 反應(yīng)管內(nèi)zui終PH值必須保證在8.0～9.0間，否則結(jié)果不穩(wěn)定；
- 配好的DTNB應(yīng)在有限期內(nèi)使用（4℃下可存1個(gè)月）；
- GSH濃度低時(shí)顯色快，消退也快；濃度高時(shí)顯色慢，消退也慢，一般反應(yīng)1～5 min后測(cè)定（不要超過(guò)5 min）；
- 反應(yīng)總體積可調(diào)為2.5 ml。