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磷酸化蛋白11點經(jīng)驗之談
閱讀：1148 發(fā)布時間：2014-2-24實驗中磷酸化蛋白有哪些經(jīng)驗之談，以下為小編總結(jié)
1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。
2. 加一抗后4℃過一夜，保證抗體有充分的結(jié)合時間。因為磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分。4℃也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。
3. 磷酸化抗體的好壞是一個關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。
4. 根據(jù)廠商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。
5. 抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)，不同廠商也會有不同要求。
6. 研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。如壓完phospho-p38抗體后，把相同的membrane做strip后再壓p38，然后再strip一次，再壓內(nèi)標(biāo)actin。
7. 做磷酸化蛋白WB時，除了目標(biāo)蛋白的band以外，往往會出現(xiàn)非特異性的band。磷酸化抗體不好的話，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘腷and，而沒有你想要的band，所以壓片以后，你一定要根據(jù)markers比對一下，你壓出的band分子量是否正確。
8. 磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深，所以壓片時間要適當(dāng)，不能太長或過短，太長則backgroud太深蓋住想要的那條band，時間過短則可能沒有band或者band太淺。
9. 磷酸化蛋白WB時，用TBST洗時也要注意一下，搖床的轉(zhuǎn)速不要太快，洗的時間不要太長，孵育一抗和二抗之后分別洗5 min 3次即可，寧愿background深一些，總比做不出來強得多。另外，洗的時候，不要把幾張membrane疊在一起洗。
10. 研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的 gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個gel，壓內(nèi)標(biāo)。但是不 建議如此做，因為這樣比較時誤差還是較大的。
11. Strip時一定要注意：membrane一定要*泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要*浸入水中，使受熱均勻。這一點很重要，要不然，隨后壓出來的總蛋白也好，內(nèi)標(biāo)也好就會不均一，無法進行比較。
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