一.ELISA 標準操作要點
的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。
1. 標本的采取和保存
大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。*過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
3.保溫
在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)
1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
4.洗滌
洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率好在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。