調(diào)試和校準(zhǔn)
流式細(xì)胞儀在使用前，甚至在使用過(guò)程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測(cè)量區(qū)的光路等。
(1) 激光強(qiáng)度調(diào)節(jié)：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長(zhǎng)的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為大。
(2) 液流速度調(diào)節(jié)：可通過(guò)操作臺(tái)數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。
(3) 測(cè)量區(qū)光路調(diào)節(jié)：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測(cè)量區(qū)的液流、激光束、90散射測(cè)量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。
流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量是相對(duì)值，因此需要在使用前或使用中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過(guò)相對(duì)測(cè)量獲得對(duì)的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
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微球用樹(shù)脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過(guò)程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑：雞血=1：4)，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測(cè)光信號(hào)為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
1.4.2 儀器的操作和使用
(1) 打開(kāi)電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；
(2) 打開(kāi)氣體閾，調(diào)節(jié) 壓力，獲得適宜的液流速度；開(kāi)啟光源冷卻系統(tǒng)；
(3) 在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；
(4) 利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為?。?/div>
(5) 選定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品;同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測(cè)量進(jìn)程；
(6) 樣品測(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；
(7) 因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤(pán)(有的機(jī)器還備有光盤(pán)系統(tǒng)，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體、測(cè)量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；
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(8) 將所需結(jié)果打印出來(lái)。
1.4.3 操作和使用中的注意事項(xiàng)
(1) 光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線下以后，需要較長(zhǎng)時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
(2) 光源不得在短時(shí)間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開(kāi);使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；
(3) 液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒；注意根據(jù)測(cè)量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；
(4) 特別強(qiáng)度每次測(cè)量都需要對(duì)照組
