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應(yīng)用簡(jiǎn)介

熒光定量PCR是檢測(cè)生物樣品中RNA含量的zui普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybrgreen和taqman法對(duì)RNA含量進(jìn)行檢測(cè)。
技術(shù)原理

1、SYBRGREENI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBRGreen染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。

2、TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團(tuán)，3’端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)，游離的完整探針是檢測(cè)不到熒光信號(hào)的，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離就可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。反應(yīng)開始時(shí)，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進(jìn)行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會(huì)從5’端逐個(gè)堿基切除探針，發(fā)光基團(tuán)會(huì)跟淬滅基團(tuán)分開，因此熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。

TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)方法
TaqMan探針法

技術(shù)總結(jié)

一、引物設(shè)計(jì)

1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；

2、Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp-150bp；

3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；

4、典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列du特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；

5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；

6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；

7、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；

8、探針位置盡可能地靠近上游引物；

9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長(zhǎng)度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C,通常比引物Tm高5~10°C，GC含量在40%~70%；

10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；

11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在Blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。

二、熱啟動(dòng)

熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。 

三、鎂離子濃度

鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如：對(duì)DNA聚合酶的活性的影響進(jìn)而影響產(chǎn)量;對(duì)引物退火的影響，進(jìn)而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。

四、模板質(zhì)量

模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會(huì)抑制PCR。

五、防止殘余污染

1、PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來(lái)源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源(非殘余污染)。

2、可以在PCR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?duì)照檢測(cè)污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。