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免疫組化染色科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：85 發(fā)布時(shí)間：2024-10-11免疫組化染色
技術(shù)原理
免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、石蠟切片制片，組織取樣后應(yīng)立即放入固定液中，避免凍存;
2、冰凍切片制片應(yīng)取用新鮮組織，以免抗原丟失;
3、組織蠟塊可以保存很長(zhǎng)時(shí)間，但是石蠟切片理論上不能超過(guò)半年。冰凍切片不能超過(guò)3個(gè)月。
注意事項(xiàng)
1. 蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其陽(yáng)性染色也在細(xì)胞核上。
2. DAB顯色時(shí)間需要達(dá)到優(yōu)化，鏡下觀察達(dá)到陽(yáng)性染色明顯但背景不太深。
3. 抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度過(guò)夜。
4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫(huà)圈時(shí)盡量畫(huà)大一點(diǎn)，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。
常見(jiàn)問(wèn)題
片子著色不均勻？
脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；
水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；
抗體沒(méi)混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；
抗體孵育時(shí)，切片放傾斜；
抗體孵育后PBS沖洗不充分。
制片厚薄不均勻等問(wèn)題。染片盒不平，切片傾斜。
一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說(shuō)要37度復(fù)溫，目的是什么？
一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；
另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？
抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制；
一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；
內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；
DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；
PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；
標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，易增強(qiáng)非特異性著色。