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相差顯微鏡的使用方法

（一）光源

    相差顯微鏡觀察的光源要滿足三個zui基本條件:*，為較強的光x。因為在相差顯

微鏡中環(huán)狀光欄限制了相當(dāng)數(shù)量的光能進入成像光路。位相板還要吸收掉直射光的60-90。庫列照明方法是滿足這一條件的zui有效措施。第二，必須吸收掉光源的熱輻射線。因為相差顯微鏡下觀察的對象中主要是生活狀態(tài)下的活細胞。在光路上設(shè)置除熱撼光片或吸熱水層可以滿足去熱條件。第三，單色光光源能夠保證正確調(diào)整生物標本的折射率差異.在光源前附加綠色濾光片足以解決這一條件.

    圖10-26展示庫列照明方法的光路。
奧林巴斯顯微鏡

    庫列照明方法的*步，要放置標本，調(diào)好焦距。其次確定光源的位里。使用傳統(tǒng)顯微鏡時.要把照明燈放置在適當(dāng)?shù)木嚯x上，使光源會聚鏡的焦面對在孔徑光欄的平面上。具體操作是:在孔徑光欄上放置磨砂玻片。當(dāng)照明燈的位置適當(dāng)時，在磨砂玻片上看到燈絲的影像。當(dāng)使用內(nèi)裝光源的顯微鏡時，燈光的距離只能用會聚鏡的位置加以調(diào)整。其次調(diào)整孔徑光欄的孔徑。為此目的，首先縮小孔徑光欄，其次拔掉目鏡，利用對焦望遠目鏡逐漸開大孔徑光欄，使其邊緣適與物鏡口徑相對應(yīng).這兩步操作完成后即可使用顯微鏡。庫列照明法的zui重要優(yōu)點是照明光線充足均勻，并消除散射光的干擾。

（二）標本

    相差顯微鏡觀察的標本基本上是未染色生物標本，或生活狀態(tài)下的生物標本。觀察這類標本時培養(yǎng)瓶壁、載玻片、蓋玻片等一切插入光路的物體的厚薄要均勻，介面要平整，否則致使光路崎變，抵消標本細節(jié)的位相差即光程差。

（三）校對光欄和相板的共轆面

    前節(jié)已述及環(huán)狀光欄與位相板的共扼關(guān)系。相差顯徽鏡的使用方法中zui關(guān)鍵性操作

就是使環(huán)狀光欄的亮環(huán)與位相板的共扼面（暗環(huán)）相對準。絕不能相互偏離，也不能大小不一。如果校對不準確.要泄漏育射光，破壞相差效果。

    為了校對共扼面，首先作到光源照明正確，放置標本，調(diào)好物鏡焦距，而后拔掉目鏡，換插校正望遠舊鏡.將望遠目鏡的接目透鏡筒（內(nèi)層管）向外抽出。抽到能看清環(huán)狀光欄的亮環(huán)和位相板的暗環(huán)為止。用固定螺旋把接目鏡鏡筒固定在此位置上，邊觀察邊調(diào)準共扼面。如果看到像圖10-27A所示環(huán)狀光欄的亮環(huán)大于位相板的暗環(huán)，或像B所示前者小于后者時，要用聚光鏡的升降來調(diào)整大小。當(dāng)看到D所示二者偏移時，用環(huán)狀光欄合軸調(diào)節(jié)螺旋調(diào)到光路中心一旦出現(xiàn)C所示的情況，即視野半邊亮另半邊暗時，調(diào)光源光軸.共扼面的正確調(diào)整以圖10-27E為準.有時出現(xiàn)多層亮環(huán)、暗環(huán)、圈套圈的情景。這就考慮環(huán)狀光欄是否處于聚光鏡的前焦面上，光源的距離是否合適等同題.校準之后拔掉校正望遠目鏡，安放原來的目鏡，進行觀察.

（四）正確選用位相板，位相板的種類與功能已在前節(jié)中介紹。有些文獻中往往用略號按指某種位相板。例如PM全文是positive medium，即暗反差（正反差）吸光率中度位相板。NH的全文是negative high，即明反差（負反差）吸光率高。DL=dark low,暗反差低吸收率，BM二bright medium，明反差中度吸收率。位相差觀察時在什么樣條件下應(yīng)該用什么種類的位相板間題，無法作出定論。因為標本的各種細節(jié)的折射率各不相同。情況變化復(fù)雜，無法固定一些條件。但是大體上可以說標本細節(jié)與介質(zhì)間反差顯著時，可用低吸收率位相板，而反差小時，用高吸收率位相板.物體形體大時用低相板，而物體過小時用高相板。一般用慣明視顯徽鏡的觀察者，使用暗反差相板會感到滿意（見圖10-25）。使用位相板的例子可引用水平敏知（1954）的表。

    當(dāng)選擇位相板時，預(yù)先側(cè)定標本的折光率，由此可以推斷其光程差.測定折光率的zui簡便的方法是由貝克、泰勒創(chuàng)制的，這方法叫貝克線。就是在顯徽鏡下放大率500 X時，觀察一個細胞或物體邊緣.當(dāng)鏡筒向下移動時，細胞邊緣的明亮的暈紋移向折射率低的介質(zhì)。鏡簡上升時沿細胞膜邊緣的紋向折射率高的細胞內(nèi)部移動.這種關(guān)系用下表展示。

   上表只能提供標本和介質(zhì)的折射率的差異。泰勒（Thaler,1930,1931）提出測定折射率的方法.這方法是:在顯微鏡放大500 X時，將被檢標本浸于已知折射率的介質(zhì)內(nèi)。顯徽鏡鏡筒提升時，貝克線移向折射率高的方向。鏡筒下降時移向相反方向。折射率相等時貝克線消失。已知介質(zhì)的折射率如下。