探針合成實(shí)驗(yàn)步驟
探針是- -小段單鏈DNA或者RNA*片段(大約是20到500 bp)， 用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素(通常用磷-32)、螢光染料或者酶 (如辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記成為探針。
實(shí)驗(yàn)材料 | 基因 |
試劑、試 劑盒 | 轉(zhuǎn)錄緩沖液DTT RNA酶抑制劑CTP ATP S-UTP乙酸銨乙醇 |
儀器、耗 材 | 水溶鍋、離心機(jī)、培養(yǎng)箱、烘箱 |
實(shí)驗(yàn)步驟 | 1.在一個(gè)含SP6. T3或T7啟動(dòng)子的載體中，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質(zhì)粒呈線(xiàn) 性。DNAL以酚/氨0仿抽提， 乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以無(wú)菌水重溶沉淀至1 ug/ul。 2.室溫配置如下反應(yīng)混合液(總體積20μl) : (1) 4.0 ul 5x轉(zhuǎn)錄緩)沖液 (2) 0.2 ul 1 mol/ DTT (3) 60 U RNA酶抑制劑 (4) 1.0 ul三種10 mmol/l NTP中的每-種 (5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA (6) 10.0μ ζ[35s] UTP (7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶 (8) 37*C溫育30 min,再加16 U聚合酶并于37 °C溫育40 min。 3.在反應(yīng)混合液中加入: 60 U RNA酶抑制劑，20 μl 10 mg/ml的載體RNA和1.0μl酶1,于37°C溫育10 min以除去摸板。 4.往反應(yīng)混合液加入以下液體: 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 無(wú)菌水和10 μI3 mol/l乙酸鈉，取出1 ul測(cè)定其cpm/ul值。 5.加36.4μ7.5 molM的乙酸銨于反應(yīng)混合液(終濃度2 mol/)加50~100 ug tRNA載體和272ul冷無(wú)水乙醇，置干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的話(huà)可重復(fù)此步。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。 6.確定其cpm/μl值， 并計(jì)算摻入百分比，核糖核酸探針應(yīng)于2~3天內(nèi)使用。 (70%到90%的標(biāo)記摻入，結(jié)果可得70~90 ng標(biāo)記的RNA) |
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