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技術(shù)文章
RT-PCR反應(yīng)體系詳解
閱讀：739 發(fā)布時間：2023-4-20 PCR反應(yīng)需要以雙鏈DNA作為模板，因此最初的PCR反應(yīng)用于檢測目標(biāo)樣本的基因組中是否存在特定的目的片段，但是這種以基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)無法檢測目的基因是否在樣本中表達(dá)，此外由于真核生物的基因中存在內(nèi)含子，直接通過基因組DNA進(jìn)行PCR也很難確定樣本中是否存在目的基因，針對這一問題，發(fā)展出了逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)。
RT-PCR技術(shù)原理：
逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，之后再進(jìn)行PCR的過程。
mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程分為兩步：
在特定引物的介導(dǎo)下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下以mRNA為模版合成互補的cDNA第一鏈；
升高溫度使cDNA第一鏈與mRNA解離，然后降溫，使其與另一引物退火結(jié)合，并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二鏈。
RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品的分析成為可能，該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：
1. RNA模板
通常20μL的逆轉(zhuǎn)錄體系，加入總RNA 1μg，如果總RNA加入過多，會導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄不充分。
2. 引物
常用的有隨機引物和Oligo(dT)引物：
隨機引物會將所有RNA分子均進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，此時得到的cDNA大部分來源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆轉(zhuǎn)錄酶終止序列而難以得到其全序列時使用；
Oligo(dT)與真核生物mRNA的Poly(A)區(qū)域匹配，可以特異性的對mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
3. 逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄過程涉及以RNA為模板合成DNA和以DNA為模板合成互補鏈的兩個過程，目前市場上的逆轉(zhuǎn)錄酶都同時具有這些功能，因此只需在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可，而不需額外加入DNA聚合酶。
4. 4種dNTPs