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   ELISA試劑盒試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線做的好與壞會直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，甚至是關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。下面將影響ELISA試劑盒曲線問題的原因做了總結(jié)：

一 OD值不正常的可能原因是：

     1、試劑盒未回溫，試劑盒回溫到25℃；

     2、溫度控制不好，控制正確溫度；

     3、孵育時間不準(zhǔn)確，控制孵育時間；

     4、洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數(shù)增 加，洗滌4-5次，每孔250ul，然后拍干；

     5、陽光直射，對著風(fēng)直接吹，避風(fēng)避光；

     6、酶標(biāo)儀的波長錯誤，酶標(biāo)儀的波長450nm；

     7、抗體的稀釋錯誤，正確的稀釋抗體；

     8、水質(zhì)問題，用娃哈哈礦泉水代替。

 

二 白板的可能原因是：

    1、洗滌液配制錯誤，正確的配制洗滌液；

    2、少加液體（錯加液體），正確的步驟加液體。

 

三 無梯度可能原因是：

   1、標(biāo)準(zhǔn)品也污染，換標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)板；

   2、OD值不正常，控制溫度時間在做一次；

   3、人為點(diǎn)板，不要點(diǎn)板。

 

四 線性不好可能原因是：

OD值不正常，控制溫度時間在做一次。

 

做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意：

1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。

2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。

3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。

4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點(diǎn)，但至少要保證有5個點(diǎn)。

6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實(shí)驗(yàn)，至少要0.99甚至是0.999。