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熒光顯微鏡原理
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像
(一)光源
現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當水銀*蒸發(fā)時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動(約為15000V)，啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。
我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用(自帶直流電源)，易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。
(二)濾色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的*個字母，G是玻璃的*個字母；我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色(藍色)拼音的*個字母，B是玻璃拼音的*個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板*以數(shù)字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當于BG12。1．激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發(fā)。
近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得zui明亮的熒光和的背景為準。
2．壓制濾板壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光(藍到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。
(三)反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
(四)聚光鏡
專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1．明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。
2．暗視野聚光器暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
(五)物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡(4×,5×，6.3×等)。
(六)目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。
(七)落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分(紫外和紫藍)由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分(綠、黃、紅等)，對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。