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樣本準備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集，例如使用 EDTA 抗凝時，要確保血液與抗凝劑充分混合。細胞培養(yǎng)上清液需以 1000×g 離心 10 分鐘，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質(zhì)。對于組織勻漿樣本，先將組織稱重后剪碎，按比例加入適量的勻漿介質(zhì)，在冰浴條件下進行充分勻漿，然后以 1000×g 離心 10 分鐘，取上清液備用。若樣本不立即使用，應(yīng)分成小份，在 - 20℃或 - 80℃環(huán)境下保存，防止反復(fù)凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致，并充分混勻。同時，依據(jù)實驗所需檢測的樣本數(shù)量，確定酶標板的使用條數(shù)，標準品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔，以提高檢測結(jié)果的準確性與可靠性。此外，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液。
加樣：在酶標板上精確設(shè)置標準品孔、空白孔與待測樣本孔。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑。加樣時，務(wù)必使用微量加樣器，并確保加樣量準確，將樣本或標準品加于酶標板孔底部，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板，使液體充分混勻。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時間，具體溫育時長參照試劑盒說明書。溫育結(jié)束后，小心揭去封板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì)。若使用洗板機進行洗滌，需提前按照儀器操作規(guī)程進行設(shè)置，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當增加 1 - 2 次。
后續(xù)反應(yīng)與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘。溫育結(jié)束后，重復(fù)上述洗滌步驟。接著，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘。顯色反應(yīng)結(jié)束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。依據(jù)標準曲線，計算出樣本中顆粒酶 B 的濃度，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實際濃度。
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結(jié)果的準確性。同時，試劑使用后應(yīng)及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì)。
樣本采集、處理過程務(wù)必嚴格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況，以免干擾檢測結(jié)果。如血清樣本應(yīng)避免溶血，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色。
洗滌過程至關(guān)重要，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì)，又要避免過度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落。洗滌液的配制應(yīng)準確無誤，洗滌次數(shù)和時間需嚴格按照說明書執(zhí)行。
加樣操作要精準、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔，保證實驗條件的一致性。使用加樣器時，需定期校準，確保加樣量的準確性。
顯色反應(yīng)過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射，以保證顯色效果的穩(wěn)定性。加入終止液后，應(yīng)盡快進行 OD 值測定，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差。
實驗過程中使用的所有耗材，如酶標板、吸頭、試管等，應(yīng)確保無污染且質(zhì)量可靠，避免對實驗結(jié)果造成影響。
若對檢測結(jié)果存在疑問或出現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時檢查實驗操作過程、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復(fù)實驗進行驗證。