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細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的表達(dá)，由于蛋白的過度表達(dá)，使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說的包涵體，另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。一般情況下，細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。

 

    超聲破碎的條件一般是300w，10s/10s，20分鐘，具體條件可根據(jù)自身情況而定。

 

    超聲前菌體的準(zhǔn)備：菌液離心后，先用PBS將菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體，裂解液的成分：50mMTris- HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切記冰浴超聲！

 

一、如何判斷是否超聲*，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般有以下幾個(gè)方面：

 

1，外  觀判 斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲*后變的透明、清澈。

2，液體的粘性：超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3，高 速 離 心：有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn)）。 沉淀是未破碎或破碎不*的菌體。

4，染         色：破碎后的菌液涂片，革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘，鏡檢。

（超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染）

 

二、一些需要注意的問題：

 

1，蛋白以包涵體形式表達(dá)，追求的是高破碎率，要求細(xì)胞碎片很小，而另一種蛋白是可溶形式表達(dá)，所以細(xì)胞碎片不能很小，兩種情況要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分離。

2，如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強(qiáng)。

3，超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。

4，盡量防止泡沫的產(chǎn)生。