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植物細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測(cè)定試劑盒

產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

植物細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氫溴化乙啶，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生紅色熒光，來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種其適用于新鮮植物組織（例如根尖、葉片等）和培養(yǎng)細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧的分析。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定，滯留持久，熒光清晰。

 

技術(shù)背景

 

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。二氫溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一種*自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，二氫溴化乙啶轉(zhuǎn)化為溴化乙啶，進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA緊密結(jié)合，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此證明細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的存在。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）	毫升
固著液（Reagent B）	毫升
離析液（Reagent C）	毫升
染色液（Reagent D）	微升
產(chǎn)品說明書	1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器

載玻片：用于組織染色操作

解剖針：用于植物組織解剖

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于用于細(xì)胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

方法一：活體組織染色

 

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

 

方法二：組織固定染色

 

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升固著液（Reagent B）
• 室溫下，孵育3小時(shí)，避免干化
• 小心移去固著液（Reagent B）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升離析液（Reagent C）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去離析液（Reagent C）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）

• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

 

方法三、培養(yǎng)植物細(xì)胞脫離染色

 

• 準(zhǔn)備1瓶25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 移出1 X 10⁶細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 再加入xx微升染色液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升清理液（Reagent A），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移，表明超氧陰離子含量高

 

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――

紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

 

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色皿

2）加入xx微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――

RFU增高，表明超氧陰離子含量高

 

方法四、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞染色

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿率達(dá)70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)4）

• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 再加入xx微升染色液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 小心抽去染色液 
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

 

• 使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：

操作容器	操作用量
載玻片	100微升
載玻片培養(yǎng)皿	1毫升
35mm培養(yǎng)皿	1毫升
96孔培養(yǎng)板	100微升
48孔培養(yǎng)板	200微升
24孔培養(yǎng)板	500微升
12孔培養(yǎng)板	1毫升
6孔培養(yǎng)板	2毫升
25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶	3毫升

 

• 本產(chǎn)品適合活體染色和固定染色，染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據(jù)不同組織類型，調(diào)整染色液（Reagent D）的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰