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50303.2 v.A

 

組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性

比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)NADPH細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）或純化微粒體樣品NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又稱(chēng)為NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一種微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）內(nèi)電子傳導(dǎo)鏈的黃素蛋白酶，參與藥物、脂肪酸、固醇類(lèi)、外源性化學(xué)分子等羥基化代謝作用，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用。通過(guò)傳遞來(lái)自NADPH的電子到細(xì)胞色素b5或細(xì)胞色素P450家系的酶，包括血紅素氧合酶等，然后鏈接到脂肪酸去飽和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH細(xì)胞色素C還原酶存在于所有組織細(xì)胞，肝組織高度表達(dá)，受到垂體-甲狀腺軸調(diào)控。NADPH細(xì)胞色素C還原酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記蛋白，飲食類(lèi)脂質(zhì)和生態(tài)污染的生物學(xué)標(biāo)記?；诘孜镅趸图?xì)胞色素C，在輔酶NADPH的存在下，由NADPH細(xì)胞色素C還原酶催化作用，產(chǎn)生還原型細(xì)胞色素C，由此出現(xiàn)吸光峰值的變化（550nm波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）            毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）            毫升

反應(yīng)液（Reagent D）            毫升

底物液（Reagent E）            毫升

陰性液（Reagent F）            毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

 

用戶(hù)自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

超速離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

1.手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)） 

2.（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3.（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4.移入一個(gè)液氮凍存管

5.即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜

6.次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

7.放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

8.加入xx毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）

9.渦旋震蕩5秒，充分混勻

10.即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

11.在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約40下）

12.將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

13.放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為9000g

14.移取上清液到2個(gè)新的1.5毫升離心管

15.放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g

16.小心抽去上清液

17.分別加入xx微升裂解液（Reagent B）

18.合并到1個(gè)1.5毫升離心管

19.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

20.即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、測(cè)定準(zhǔn)備

 

1．準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里

2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為550nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

 

三、背景對(duì)照測(cè)定

 

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5．加入xx微升陰性液（Reagent F）

6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：550波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘－550波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 

 

四、樣品活性測(cè)定

 

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5．加入50微升待測(cè)樣品（注意：100微克微粒體蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）

6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：550波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘－550波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘

 

五、計(jì)算樣品活性

 

注意事項(xiàng)

 

1．本產(chǎn)品為20次（比色皿）操作，包括背景對(duì)照

2．操作時(shí)，須戴手套

3．系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4．樣品須澄清，至關(guān)重要 

5．加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測(cè)定

6．分光光度計(jì)波長(zhǎng)嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號(hào)

7．測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可以持續(xù)5分鐘

8．測(cè)定值由低到高變化，即5分鐘測(cè)定讀數(shù)高于0分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性

9．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

10．建議待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測(cè)樣本為組織裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1） 

11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

12．通常每毫克肝組織蛋白含有1至5毫單位NADPH細(xì)胞色素C還原酶

13．NADPH細(xì)胞色素C還原酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾細(xì)胞色素C所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14．本公司提供系列NADPH細(xì)胞色素C還原酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

 

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感