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ELISA技術(shù)之酶標(biāo)儀
閱讀：1277 發(fā)布時(shí)間：2015-1-19為微孔板比色計(jì)的酶標(biāo)儀，其基本功能不外乎一個(gè)比色測(cè)定，所不同的是在測(cè)定波長(zhǎng)范圍、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、震板功能、溫度控制、定性和定量測(cè)定軟件功能等方面的差異，當(dāng)然全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動(dòng)洗板、溫育、加樣等功能。在臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作中，實(shí)驗(yàn)人員在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定操作時(shí)，有時(shí)難免會(huì)對(duì)酶標(biāo)儀的一些性能指標(biāo)產(chǎn)生迷惑，甚至對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解。如諸如使用酶標(biāo)儀較用肉眼觀察測(cè)定的陽(yáng)性率明顯增加這樣的問(wèn)題。
測(cè)定波長(zhǎng)目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）。底物通常為四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD），其在過(guò)氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處有大吸收，當(dāng)pH值降為L(zhǎng) 0時(shí)，大吸收波長(zhǎng)移至492 nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過(guò)量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定常用的。
各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6~8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng)，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大 一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)在400~750nm或800nm之間，*可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。