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線粒體呼吸鏈復(fù)合物III 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
線粒體呼吸鏈復(fù)合物III（輔酶Q-細(xì)胞色素C 還原酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用還原性合
成輔酶Q 同功類(lèi)似物和特異性抑制劑，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定樣品中細(xì)胞色素C 還原后峰值的增高，即采用比
色法測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種
純化線粒體樣品（動(dòng)物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的輔酶Q-細(xì)胞色素C 還原酶的特異性
活性檢測(cè)?？捎糜谒ダ?、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，
嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
線粒體呼吸鏈復(fù)合物III，通常稱(chēng)為輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素還原酶或bc1復(fù)合物（ubiquinol
cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是線粒體電子傳遞鏈的中心元素：含有
十一個(gè)亞單位，包括細(xì)胞色素b（Cytochrome b），細(xì)胞色素c1（cytochrome c1）和Rieske鐵硫蛋白（Rieske
iron-sulfur protein），通過(guò)Q循環(huán)（Q cycle）進(jìn)行催化作用。其特征性的酶活性是敏感的輔酶Q－細(xì)
胞色素C還原酶。復(fù)合物III催化氧化型細(xì)胞色素C被還原為還原型細(xì)胞色素C，線粒體內(nèi)電子由供體還原型
泛醌（ubiquinol；UQH2）或還原型輔酶Q（reduced Coenzyme Q；CoQH2）傳遞到細(xì)胞色素C上的能量轉(zhuǎn)移
反應(yīng)，進(jìn)行呼吸鏈傳遞。該酶異常會(huì)導(dǎo)致心肌疾病。輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定氧化型細(xì)胞色
素C的濃度變化?；谶€原型泛醌或還原型輔酶Q底物，在存在與否的情況下，通過(guò)輔酶Q-細(xì)胞色素
C還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成泛醌（ubiquinone；UQ）或輔酶Q（Coenzyme Q；CoQ），同時(shí)氧化型細(xì)胞色素C，
轉(zhuǎn)化為還原型細(xì)胞色素C，在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化（550nm 波長(zhǎng)），由此定量測(cè)定輔酶Q－
細(xì)胞色素C還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液（Reagent A） 毫升
反應(yīng)液（Reagent B） 微升
陰性液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 微升
專(zhuān)性液（Reagent E） 微升
穩(wěn)定液A（Reagent F1） 管
穩(wěn)定液B（Reagent F2） 毫升
說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保證
3 月
用戶(hù)自備
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液
（Reagent D）注意避光。
一、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為550nm，間隔60 秒，讀數(shù)3 次（共2 分鐘），并置零
3． 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
4． 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的穩(wěn)定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出xx 毫
升到穩(wěn)定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標(biāo)記為穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后丟
棄）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent B）室溫下融化，然后移出10 微升到新的1.5
毫升離心管，加入xx 微升穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15 分鐘（可見(jiàn)顏色變白），標(biāo)記
為反應(yīng)工作液。然后即刻進(jìn)行下列操作
二、背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入xx 微升反應(yīng)工作液
3． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 室溫下靜置10 分鐘，避免光照
5． 加入xx 微升陰性液（Reagent C）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：550 波長(zhǎng)讀數(shù)1 分鐘或2 分鐘－550 波長(zhǎng)讀數(shù)0 分鐘
三、樣品總活性測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入xx 微升反應(yīng)工作液
3． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 室溫下靜置10 分鐘，避免光照
5． 加入100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：550 波長(zhǎng)讀數(shù)1 分鐘或2 分鐘－550 波長(zhǎng)讀數(shù)0 分鐘
四、樣品非特異活性測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入xx 微升反應(yīng)工作液，避免光照
3． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 室溫下靜置10 分鐘，避免光照
5． 加入xx 微升專(zhuān)性液（Reagent E）
6． 加入100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
8． 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：550 波長(zhǎng)讀數(shù)1 分鐘或2 分鐘－550 波長(zhǎng)讀數(shù)0 分鐘
五、計(jì)算樣品活性
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
2）樣品特異活性
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為21 次操作（10 個(gè)樣本），包括1 次背景對(duì)照測(cè)定
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1 次
4． 線粒體樣品檢測(cè)前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3 次
5． 如果增強(qiáng)酶活檢測(cè)，建議使用線粒體復(fù)合物待測(cè)樣品預(yù)處理試劑盒
6． 每增加1 個(gè)樣品，增加反應(yīng)工作液為：反應(yīng)液（Reagent D）5 微升＋穩(wěn)定工作液5 微升，以此類(lèi)推。
配制反應(yīng)工作液時(shí)，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量
7． 用戶(hù)可以根據(jù)實(shí)際樣品，計(jì)算緩沖液（Reagent A）、反應(yīng)工作液和底物液（Reagent D）三者之和，混
勻后，室溫下靜置10 分鐘，置于冰槽里等待檢測(cè)
8． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3 秒內(nèi)即刻比色測(cè)定
9． 分光光度計(jì)波長(zhǎng)嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm 將不產(chǎn)生信號(hào)
10．測(cè)定可以持續(xù)2 分鐘
11．測(cè)定值由低到高變化，即2 分鐘測(cè)定讀數(shù)高于0 分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
12．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
13．建議用戶(hù)使用分光光度儀檢測(cè)，總體系減半可以增加檢測(cè)樣本數(shù)
14．建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為10 微克/100 微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣
本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整
15．如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50 微克/100 微升
16．樣品特異活性是指敏感的輔酶Q－細(xì)胞色素C 還原酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物I/II/IV
等）
17．線粒體呼吸鏈復(fù)合物III（輔酶Q－細(xì)胞色素C 還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5 條件下，每
分鐘內(nèi)能夠氧化1 微摩爾還原型泛醌（CoQH2）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
18．本公司提供系列線粒體及其酶類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確