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動(dòng)物細(xì)胞/組織活性線粒體分離試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

動(dòng)物細(xì)胞/組織活性線粒體分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的活性線粒體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細(xì)胞的活性線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，可以被用于線粒體酶活性、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品佳。

技術(shù)背景

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃

冰箱里，有效保證 6 月

用戶自備

HANK 平衡鹽緩沖溶液（12028）或 PBS 緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離*細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基

15 毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50 毫升錐形離心管：用于細(xì)胞或組織收集后離心或清洗

1.5 毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分 DOUNCE 勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、動(dòng)物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升凈化液（Reagent C）和 4 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹 12 至 24 小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 50 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1    次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的 xx 毫升裂解工作液

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放入預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約 80 下）（注意：參見注意事項(xiàng) 8）

9． 將所有組織勻漿物移入 15 毫升錐形離心管，

10．放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g

11．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

12．放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

13．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

14．（選擇步驟）加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

15．（選擇步驟）放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

16．（選擇步驟）小心抽去上清液

17．加 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

18．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動(dòng)物軟組織線粒體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹 12 至 24 小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 50 毫升錐形離心管3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1 次4． 移入一個(gè)液氮凍存管

5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個(gè) 15 毫升錐形離心管

8． 加入預(yù)冷的 xx 毫升 裂解工作液

9． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

10．在冰槽里孵育 2 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒

11．加入預(yù)冷的 xx 微升 強(qiáng)化液（Reagent D）

12．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

13．在冰槽里孵育 5 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒（注意：參見注意事項(xiàng) 9）

14．加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E），用手混勻

15．放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g

16．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

17．放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

18．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

19．（選擇步驟）加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

20．（選擇步驟）放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

21．（選擇步驟）小心抽去上清液

22．加入 xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻

23．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

三、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（細(xì)胞勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升 凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 5 至 10 瓶 75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面

2． 分別加入 10 毫升用戶自備的 HANK 平衡鹽緩沖溶液或 PBS 緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)    瓶表面，

3． 小心抽去清洗液

4． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 2 至 3 一次

5． 加入 3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面

6． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱孵育 3 分種

7． 手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

8． 分別加入 10 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

9． 全部移入到一個(gè) 50 毫升錐形離心管

10．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 200g

11．小心抽去上清液

12．加入 xx 毫升預(yù)冷的 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

13．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 300g

14．小心抽去上清液

15．加入預(yù)冷的 xx 毫升裂解工作液

16．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

17．即刻放進(jìn)預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化細(xì)胞（約 80 下）（注意：參見注意事項(xiàng) 8）

18．將所有細(xì)胞勻漿物移入 15 毫升錐形離心管

19．放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g

20．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

21．放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

22．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

23．（選擇步驟）加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

24．（選擇步驟）放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

25．（選擇步驟）小心抽去上清液

26．加入 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

27．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

四、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升 活性液（Reagent F）、xx 毫升 凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 5 至 10 瓶 75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面

2． 分別加入 10 毫升用戶自備的 HANK 平衡鹽溶液或 PBS 溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面

28．小心抽去清洗液

3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 2 至 3 一次

4． 加入 3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面

5． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱孵育 3 分種

6． 手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

7． 分別加入 10 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 全部移入到一個(gè) 50 毫升錐形離心管

9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 200g

10．小心抽去上清液

11．加入 xx 毫升預(yù)冷的 清理液（Reagent A）

12．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 300g

13．小心抽去上清液

14．加入預(yù)冷的 xx 毫升 裂解工作液

15．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

16．在冰槽里孵育 2 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒

17．加入預(yù)冷的 xx 微升 強(qiáng)化液（Reagent D）

18．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

19．在冰槽里孵育 5 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒（注意：參見注意事項(xiàng) 9）

20．加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E），用手混勻

21．放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g

22．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

23．放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

24．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

25．（選擇步驟）加入預(yù)冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

26．（選擇步驟）放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

27．（選擇步驟）小心抽去上清液

28．加入 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

29．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

注意事項(xiàng)

 1． 本產(chǎn)品為 10 次（1 克動(dòng)物組織或 5 X 10⁷細(xì)胞）或 50 次（200 毫克動(dòng)物組織或 1 X 10⁷細(xì)胞）     操作

 2． 實(shí)際操作的動(dòng)物組織重量或細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如 200 毫克動(dòng)物組織：試劑用量是標(biāo)

 準(zhǔn)用量的五分之一

 3． 所有操作均須在 4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行

 4． 操作時(shí)，須戴手套

5． 操作時(shí)，須無(wú)菌操作，避免污染母液，尤其是 裂解液（Reagent B）和 保存液

（Reagent E）

6． 建議使用足夠的樣品量

7． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間

8． 通常勻化次數(shù)為 80 下達(dá)到 80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶     可以通過顯微鏡觀察 3 微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于 50％可以增加     勻化次數(shù)

9． 通常孵育 5 分鐘達(dá)到 80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過    顯微鏡觀察 3 微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于 50％可以增加孵育時(shí)間和    渦旋震蕩次數(shù)

10．對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，例如 HeLa 細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

11．通常 5 X 10⁷細(xì)胞或 1 克動(dòng)物組織的線粒體含量為 50 微克以上線粒體蛋白

12．如果需要計(jì)量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

13．本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提

的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應(yīng)減少

14．如果需要獲得99％以上純度的線粒體，使用 動(dòng)物細(xì)胞/組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒－

10006.3

15．線粒體正?；钚詼y(cè)定方法是： CITRATE SYNTHASE 活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等

16．線粒體內(nèi)外膜完整測(cè)定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE 活性和熒光 JC 染色

17．本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等

18．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能長(zhǎng)期穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正?；钚?/span>

4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶