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動物細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 動物細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學(xué)方法，快速有效地裂解動物細(xì)胞，通過高速離心，獲得澄清細(xì)胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應(yīng)體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發(fā)光底物，水解所產(chǎn)生的發(fā)光產(chǎn)物，通過發(fā)光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進(jìn)行測算酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后的活體細(xì)胞外源性以及衰老細(xì)胞內(nèi)源性半乳糖苷酶活性分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡便、高度敏感。 技術(shù)背景 大腸桿菌的標(biāo)志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩(wěn)定，對蛋白水解降解作用抗性強(qiáng)，且容易測試。因此β-半乳糖苷酶成為目前常用的報(bào)告基因，以評價(jià)載體轉(zhuǎn)染的效果。在衰老細(xì)胞內(nèi)，顯示β-半乳糖苷酶活性。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發(fā)光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶（pH7.8）的催化下，去糖基化后，產(chǎn)生二惡二酮，進(jìn)而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動反應(yīng)作用下，同時(shí)pH調(diào)整到12，由此二惡二酮分解，發(fā)出冷光，在冷光儀（475nm波長）下，檢測發(fā)光信號，來測定β-半乳糖苷酶的活性。其發(fā)光產(chǎn)物半衰期為10分鐘，檢測敏感度可達(dá)20飛克（fg）。 ? 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 稀釋液（Reagent C） 微升 反應(yīng)液（Reagent D） 微升 堿性液（Reagent E） 毫升 啟動液（Reagent F） 微升 陰性液（Reagent G） 毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照；堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月 用戶自備 β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)樣：用于建立β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器 細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離 （微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作 黑色96孔板或酶標(biāo)板：用于冷光檢測操作的容器 恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育 冷光儀：用于樣品冷光檢測 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，開啟化學(xué)發(fā)光儀預(yù)熱，設(shè)置波長475nm；開啟恒溫水槽，設(shè)置溫度為37℃。同時(shí)從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照。然后進(jìn)行下列操作： 一、樣品準(zhǔn)備 1．準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞） 2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面 3．小心抽去清理液 4．使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化） 5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞 6．移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始） 7．放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g 8．小心抽去上清液 9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻 10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管 11．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒 12．置于冰槽里孵育30分鐘 13．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 14．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管 15．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒) 16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、測定準(zhǔn)備 1．從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里 2．反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）嚴(yán)格注意避光 3．設(shè)定好化學(xué)發(fā)光儀：溫度為30℃預(yù)熱和運(yùn)行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 4．然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室的燈光 三、活性檢測 檢測開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出xx微升稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室里。同時(shí)移出xx微升堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入xx微升啟動液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為啟動工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。 1．準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔酶標(biāo)板，并做好標(biāo)記：包括背景對照和待測樣品 2．分別加入xx微升反應(yīng)工作液到所有測試孔里 3．加入xx微升陰性液（Reagent G）到背景對照孔里 4．加入5微升待測樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到待測樣品孔里 5．輕輕搖動酶標(biāo)板，混勻 6．室溫下孵育60分鐘，避免光照 7．分別加入xx微升啟動工作液到所有測試孔里 8．輕輕搖動酶標(biāo)板，混勻 9．室溫下靜置10秒，嚴(yán)格避免光照 10．即刻放進(jìn)冷光儀檢測：5秒整合檢測 11．獲得相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU） 四、樣品活性分析 五、樣品β-半乳糖苷酶實(shí)際活性單位計(jì)算（建議使用 β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒） 1)構(gòu)建β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫座標(biāo)（x軸）為每毫升β-半乳糖苷酶單位濃度；縱坐標(biāo)（y軸）為標(biāo)準(zhǔn)樣品讀數(shù)（吸光單位OD值） 2)根據(jù)β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算樣品中含有β-半乳糖苷酶的活性單位（單位/毫克樣品） 注意事項(xiàng) 1．本產(chǎn)品為20次操作 2．建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織 3．本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到優(yōu)化 4．操作時(shí)，須戴手套 5．反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個(gè)操作須避光進(jìn)行，避免反復(fù)凍融 6．測讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行 7．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次 8．用戶可以測定細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計(jì)算活性單位之需；建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量檢測試劑盒 9．加入啟動工作液10秒后，即刻進(jìn)行冷光測定 10．如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計(jì)數(shù)器）替代，但敏感性較低 11．如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道 12．相對發(fā)光讀數(shù)RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高 13．測定后，測定杯須清洗* 14．建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量 15．用戶可以使用β-半乳糖苷酶構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品酶活性單位檢測或使用 β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒 16．本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感