• 在精子卵子授精后14-19小時期間觀察原核。
• 操作環(huán)境：百級凈化環(huán)境中操作，配備溫度37℃加熱板的體視鏡下觀察。
• 挑選合適尖吸管用于剝離“受精卵”外層卵丘細(xì)胞（可實(shí)驗(yàn)自制或者購買剝卵針），尖吸管內(nèi)直徑稍微大于卵母細(xì)胞的直徑。使用尖吸管前請?jiān)隗w視鏡觀察尖吸管頭部是否完好和內(nèi)直徑是否合適（管內(nèi)直徑120微米左右）。
• 取卵當(dāng)日為每個IVF/ICSI患者準(zhǔn)備胚胎培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿周圍用卵裂液（如G1，或Gm）做8-10個微滴，中間3-4個微滴備沖洗，每個胚胎培養(yǎng)微滴用液約15ul，其上蓋滿 礦物油。將準(zhǔn)備好的胚胎培養(yǎng)皿放入CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)平衡通宵。
• 了解患者通宵精子的情況：如未提示通宵精子培養(yǎng)液中未見較多密集的顆粒狀物，可以開始觀察原核操作；如提示通宵精子培養(yǎng)液中可見較多密集的顆粒狀物，可能發(fā)生“受精卵”污染，請zui后觀察，具體操作見補(bǔ)充說明。
• 準(zhǔn)備以上條件后，從培養(yǎng)箱取出患者授精的4孔培養(yǎng)皿，與實(shí)驗(yàn)室記錄單核對夫妻雙方名字及核對所觀察的的“卵子”數(shù)目。
• RT受精卵的原核檢查，需先剝除外層卵丘細(xì)胞。使用前尖吸管可用授精培養(yǎng)液體潤洗下。體視鏡下，尖吸管在授精孔吹吐“受精卵”，剝離“受精卵”外層卵丘細(xì)胞。開始時，先剝離一個“受精卵”，如順利，之后可以3-4個受精卵一起剝離。
• 原核檢查：剝離顆粒細(xì)胞后，使用尖吸管將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入備好的胚胎培養(yǎng)皿內(nèi)（ICSI受精卵直接轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)皿內(nèi)），在體視鏡下（80X）進(jìn)行原核觀察，如解剖鏡下顯示不清需在倒置鏡下（200X）下觀察。
• 將受精卵在中間3個培養(yǎng)滴進(jìn)行清洗后，按2PN，1PN，0PN（無原核，可為2pb，MII），MI，GV，3PN/多PN（3個以上原核）等受精情況情況進(jìn)行分類放置，每個培養(yǎng)滴放1-5枚胚胎（如果胚胎數(shù)超過30建議使用2個及以上培養(yǎng)皿）。標(biāo)記核對患者夫妻雙方名字于胚胎培養(yǎng)的小皿，與患者四孔培養(yǎng)皿一直放入培養(yǎng)箱，位置與原來相同。作好受精情況記錄，記錄包括受精情況，位置，培養(yǎng)液，觀察時間，操作者。
• 如果“受精卵”剝離和觀察是在空氣環(huán)境下，此操作過程不能超過十分鐘。
• 一位患者受精觀察結(jié)束后銷毀使用過的尖吸管，開始下一位患者的觀察。

補(bǔ)充說明

1．常規(guī)受精失敗或常規(guī)受精率低于20%：觀察未受精卵成熟情況；了解通宵精子的情況，及四孔精子情況，判斷是否補(bǔ)救ICSI，和是否發(fā)生污染。

2．補(bǔ)救ICSI：如果常規(guī)受精失敗，或受精率低于20%。

●原則是盡可能保證患者有一次胚胎移植機(jī)會。

●常規(guī)受精*失敗視卵成熟情況和卵子質(zhì)量好壞決定是否進(jìn)行補(bǔ)救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2，受精卵形態(tài)正常，可以考慮不補(bǔ)救ICSI。

如果正常受精2PN＜2，且有5個以上正常形態(tài)MII，建議補(bǔ)救ICSI。

●及時補(bǔ)救ICSI。

●如補(bǔ)救，第二天請先觀察補(bǔ)救ICSI受精情況。

3．污染問題：

污染提示：

• 通宵精子培養(yǎng)液中見較多密集的顆粒狀物。
• 受精的4孔培養(yǎng)液有渾濁的情況發(fā)生。
• 常規(guī)受精*沒有受精。

污染觀察：倒置顯微鏡下（200X或400X）下觀察確認(rèn)。

污染處理：*種情況: 4孔培養(yǎng)液中布滿大量的顆粒狀物，精子大多數(shù)不活動，顆粒細(xì)胞貼壁生長差，可以當(dāng)日行精液及胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

第二種情況:如上述情況不是很明顯，到D3移植日再觀察決定。這種情況下如果常規(guī)*未受精可以行補(bǔ)救ICSI。

D3觀察：●胚胎培養(yǎng)滴中未發(fā)現(xiàn)顆粒，移植。

 ●胚胎培養(yǎng)滴中發(fā)現(xiàn)顆粒，不移植，精液及胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)。

 ●胚胎培養(yǎng)滴中難以確定顆粒，囊胚培養(yǎng)后決定？胚胎冷凍，胚胎胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定？ 

初步判斷污染來源：

●提示精子來源污染；

通宵精子培養(yǎng)液有明顯大量顆粒，培養(yǎng)卵母細(xì)胞的四孔中間背景干凈，浸洗卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿背景干凈。

●提示卵子來源污染；通宵精子培養(yǎng)液未見較多密集的顆粒狀物，且精子活力良好，培養(yǎng)卵母細(xì)胞的四孔中間可見較多密集的顆粒狀物，浸洗卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿背景可見較多密集的顆粒狀物。

補(bǔ)充

1．常規(guī)受精失敗或常規(guī)受精率低于20%：觀察未受精卵成熟情況；了解精子的情況，及四孔精子情況，判斷是否補(bǔ)救ICSI，和是否發(fā)生污染。

2．補(bǔ)救ICSI：如果常規(guī)受精失敗，或受精率低于20%。

●原則是盡可能保證患者有一次胚胎移植機(jī)會。

●常規(guī)受精*失敗視卵成熟情況和卵子質(zhì)量好壞決定是否進(jìn)行補(bǔ)救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2，受精卵形態(tài)正常，可以考慮不補(bǔ)救ICSI。

如果正常受精2PN＜2，且有5個以上正常形態(tài)MII，建議補(bǔ)救ICSI。

●及時補(bǔ)救ICSI。

●如補(bǔ)救，第二天請先觀察補(bǔ)救ICSI受精情況。

3．污染問題：

污染提示：

• 精子培養(yǎng)液中見較多密集的顆粒狀物。
• 受精的4孔培養(yǎng)液有渾濁的情況發(fā)生。
• 常規(guī)受精*沒有受精。

污染觀察：倒置顯微鏡下（200X或400X）下觀察確認(rèn)。

污染處理：*種情況: 4孔培養(yǎng)液中布滿大量的顆粒狀物，精子大多數(shù)不活動，顆粒細(xì)胞貼壁生長差，可以當(dāng)日行精液及胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

第二種情況:如上述情況不是很明顯，到D3移植日再觀察決定。這種情況下如果常規(guī)*未受精可以行補(bǔ)救ICSI。

D3觀察：●胚胎培養(yǎng)滴中未發(fā)現(xiàn)顆粒，移植

●胚胎培養(yǎng)滴中發(fā)現(xiàn)顆粒，不移植，精液及胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)。

●胚胎培養(yǎng)滴中難以確定顆粒，囊胚培養(yǎng)后決定？胚胎冷凍，胚胎胚胎培養(yǎng)液的細(xì)菌培養(yǎng)鑒

 初步判斷污染來源：

●提示精子來源污染；

精子培養(yǎng)液有明顯大量顆粒，培養(yǎng)卵母細(xì)胞的四孔中間背景干凈，浸洗卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿背景干凈。

●提示卵子來源污染；精子培養(yǎng)液未見較多密集的顆粒狀物，且精子活力良好，培養(yǎng)卵母細(xì)胞的四孔中間可見較多密集的顆粒狀物，浸洗卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿背景可見較多密集的顆粒狀物。