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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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近年來，抗體藥、疫苗和細(xì)胞基因治療產(chǎn)品等生物制品因具有更強(qiáng)的特異性、能與分子靶點(diǎn)結(jié)合、療效好、副作用少等特點(diǎn)，獲得快速發(fā)展。然而生物制品成分多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生產(chǎn)工藝也各不相同，在制備過程中較容易受到污染和產(chǎn)生雜質(zhì)。
常見的污染物是指帶入的外源性物質(zhì)，如生物性原材料攜帶的病原微生物（eg.細(xì)菌、支原體、分枝桿菌、內(nèi)源性病毒和外界污染的病毒）。雜質(zhì)一般分為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包括聚體、降解產(chǎn)物、電荷異構(gòu)體、疏水變體、無活性的病毒顆粒、非目的范圍的多糖、包裝不完整的病毒樣顆粒等。工藝相關(guān)雜質(zhì)包括細(xì)胞基質(zhì)（宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞DNA）、細(xì)胞培養(yǎng)物（誘導(dǎo)劑、抗生素或培養(yǎng)基成分）或下游工藝殘留物。這些雜質(zhì)和污染物等不僅會(huì)影響生物藥的藥效，還可能存在安全性隱患，因此藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量管控。
其中，宿主細(xì)胞殘留DNA（HCD）和支原體的檢測(cè)是大多數(shù)生物制品質(zhì)檢項(xiàng)目中普遍存在且又非常重要的兩個(gè)檢項(xiàng)。對(duì)于HCD和支原體的檢測(cè)主要包括四個(gè)大步驟：
1）制備待測(cè)樣本；
2）待測(cè)樣本的核酸提取；
3）qPCR反應(yīng)體系配制和擴(kuò)增；
4）數(shù)據(jù)分析。
圖1. 宿主細(xì)胞中殘留DNA檢測(cè)流程圖
由于生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)過程需要經(jīng)過離心、過濾、親和層析、離子交換等多個(gè)環(huán)節(jié)，因此這些生物制品的中間品、半成品和成品中的殘留DNA等雜質(zhì)基本是微量的。此外，這些生物制品還通常是以高濃度的蛋白/核酸等形式存在的。若在這些情況下，直接采用定量PCR方法檢測(cè)外源性殘留DNA，則容易受核酸純度、樣本復(fù)雜性、qPCR反應(yīng)抑制等因素影響，無法對(duì)微量殘留DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
2020年版《中華人民共和國藥典》三部通則3407外源性DNA殘留量測(cè)定法提到：供試品處理，可根據(jù)需要對(duì)供試品進(jìn)行稀釋，也可按碘化鈉沉淀法或磁珠法等方法濃縮純化DNA。目前，磁珠法以其操作簡(jiǎn)便、純度高且可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域質(zhì)量安全控制檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)的樣本前處理中。
磁珠法的核酸提取，利用緩沖體系、磁珠親和吸附作用，可將生物制品中微量DNA從復(fù)雜的蛋白質(zhì)、緩沖液和鹽混合物中高效回收，且殘留DNA的純度和靈敏度也能較好的保障。
磁珠法的核酸提取又分為手動(dòng)提取和自動(dòng)化提取兩種方案，通常樣本量少、實(shí)驗(yàn)時(shí)間充足的情況下，選擇手動(dòng)提取即可。但手動(dòng)提取全程需要人力操作和時(shí)間精力的投入，無法同時(shí)開展其他的工作。此外，一旦待檢樣本數(shù)量增多，手動(dòng)提取就較難滿足實(shí)際需求了，并且樣本量多時(shí)手動(dòng)提取還容易產(chǎn)生人工誤差。
采用自動(dòng)化的核酸提取儀器可以解決上述這些問題，并具有如下優(yōu)點(diǎn)：
核酸純化系統(tǒng)可以快速、高效地提取純凈的核酸；
具有高通量性能，可以同時(shí)處理多個(gè)樣本；
通常具有自動(dòng)化的功能，以減少實(shí)驗(yàn)中的操作步驟和人工誤差；
通常配備了預(yù)裝的核酸提取試劑盒，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程和樣品處理的體積；
采用無廢液和封閉式的處理方式，避免交叉污染，確保樣品的純凈性，同時(shí)減少操作的變異性。
手動(dòng)提取
自動(dòng)化提取
圖2. 手動(dòng)提取和自動(dòng)核酸提取操作流程圖
翌圣生物-全自動(dòng)核酸提取儀
基于磁珠法樣本前處理手動(dòng)提取和自動(dòng)化核酸提取儀器的上述優(yōu)勢(shì)，以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域質(zhì)量安全控制方向宿主細(xì)胞殘留DNA（HCD）和支原體的檢測(cè)對(duì)于樣本前處理和自動(dòng)化核酸提取的需求。翌圣生物依托法規(guī)藥典要求，并結(jié)合市場(chǎng)需求，推出了一系列自動(dòng)核酸提取儀（包括16、48、96通道）。
這些核酸提取儀器配套對(duì)應(yīng)的預(yù)封裝磁珠法樣本前處理試劑盒，可實(shí)現(xiàn)核酸的高通量提取，為客戶提供樣本前處理、自動(dòng)化核酸提取到殘留DNA和支原體污染檢測(cè)等全套完整解決方案。目前這些設(shè)備已經(jīng)經(jīng)過不同生物制品核酸殘留檢測(cè)、核酸安全性檢測(cè)等方法的適用性驗(yàn)證，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥企業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
快速高通量：可任選16、48、96通道提取儀，可同時(shí)最多提取96個(gè)樣本，操作時(shí)間10min～60min；
試劑兼容性：基于翌圣核酸提取純化平臺(tái)，適配各種磁珠法提取試劑盒以及預(yù)封裝試劑盒；
污染控制：實(shí)驗(yàn)艙具備負(fù)壓HEPA排氣過濾模塊，內(nèi)置紫外消毒模塊，防止樣本污染；
體積小巧：儀器外觀設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔，16和48通道儀器都相對(duì)小巧便攜，節(jié)約實(shí)驗(yàn)空間；
樣品保護(hù)：有開機(jī)自檢、靜音運(yùn)行、高溫報(bào)警、過溫保護(hù)等功能，減少樣品損失；
提醒功能：具備不上磁套提醒功能，避免磁棒套污染影響儀器壽命；
智能化操作系統(tǒng)：機(jī)載觸摸屏，界面簡(jiǎn)潔，中英文雙系統(tǒng)自由切換。
解決的痛點(diǎn)
待檢測(cè)樣本量大，人力資源不夠用；
手提實(shí)驗(yàn)操作步驟復(fù)雜和有人工誤差；
少量樣本，也可使用小通量提取儀，解放雙手。
應(yīng)用實(shí)例
翌圣16通道核酸提取儀、搭配ABI 7500熒光定量PCR儀，在Vero殘留DNA檢測(cè)中的應(yīng)用。
分別制備高中低濃度：30pg/μL、300fg/μL、3fg/μL的Vero殘留DNA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，采用預(yù)封裝的磁珠法樣本前處理試劑盒搭配16通道自動(dòng)化核酸提取儀器對(duì)樣本提取后檢測(cè)，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)提取重復(fù)，每個(gè)提取做3個(gè)測(cè)試重復(fù)，分析樣本回收率和CV。對(duì)于不同濃度Vero DNA樣品回收率均在70%~130%之間，CV均<20%。
表1. 空白樣本加標(biāo)回收率
用5份不同背景溶液（高蛋白、高核酸、高鹽、高低PH）對(duì)同一濃度樣本（300fg/μL的Vero殘留DNA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品）提?。ú捎妙A(yù)封裝的磁珠法樣本前處理試劑盒搭配16通道自動(dòng)化核酸提取儀器），每種背景溶液進(jìn)行3個(gè)提取重復(fù)，每個(gè)提取做3個(gè)測(cè)試重復(fù)，分析樣本回收率和CV。對(duì)于不同背景溶液的DNA樣本回收率均在70%~130%之間，CV均<20%。
表2. 模擬樣本加標(biāo)回收率
產(chǎn)品信息
翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
宿主殘留DNA檢測(cè) | CHO宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒（3G） | 41332ES50/60 | 50T/100T |
HEK293宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒（3G） | 41331ES50/60 | 50T/100T | |
Human宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41331ES50/60 | 50T/100T | |
Vero宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒（2G） | 41307ES50/60 | 50T/100T | |
E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒（2G） | 41308ES50/60 | 50T/100T | |
漢遜酵母宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41317ES50/60 | 50T/100T | |
MDCK宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41319ES50/60 | 50T/100T | |
釀酒酵母宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41324ES50/60 | 50T/100T | |
畢赤酵母宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41328ES50/60 | 50T/100T | |
Sf9和桿狀病毒DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41330ES50/60 | 50T/100T | |
質(zhì)粒DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41323ES50/60 | 50T/100T | |
殘留DNA片段分析 | Vero宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒 | 41314ES70/74 | 4×50T/4×100T |
HEK293宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒 | 41316ES70/74 | 4×50T/4×100T | |
Human宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒 | 41326ES70/74 | 4×50T/4×100T | |
CHO宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析試劑盒 | 41334ES70/74 | 4×50T/4×100T | |
宿主殘留RNA檢測(cè) | E.coli宿主細(xì)胞RNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 41318ES50/60 | 50T/100T |
風(fēng)險(xiǎn)基因檢測(cè) | SV40LTA&E1A殘留DNA檢測(cè)試劑盒 | 41310ES50/60 | 50T/100T |
CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒 | 41313ES50/60 | 50T/100T | |
復(fù)制型慢病毒(RCL)檢測(cè)試劑盒 | 41311ES50/60 | 50T/100T | |
RCA (E1A)基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒 | 41321ES50/60 | 50T/100T | |
復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測(cè)試劑盒 | 41327ES50/60 | 50T/100T | |
復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)檢測(cè)試劑盒 | 41329ES50/60 | 50T/100T | |
慢病毒物理滴度qPCR檢測(cè)試劑盒 | 41333ES50/60 | 50T/100T | |
HIV-1 p24 ELISA Kit | 99301ES24/48/96 | 24T/48T/96T | |
支原體檢測(cè) | 支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針法）（2G） | 40619ES25/60 | 25T/100T |
支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（探針法） | 40618ES25/60 | 25T/100T | |
宿主殘留蛋白檢測(cè) | E.coli HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36712ES48/96 | 48T/96T |
E.coli HCP ELISA檢測(cè)試劑盒（質(zhì)粒） | 36721ES48/96 | 48T/96T | |
HEK293 HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36713ES48/96 | 48T/96T | |
畢赤酵母HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36720ES | 48T/96T | |
核酸酶殘留檢測(cè) | 全能核酸酶檢測(cè)試劑盒 | 36701ES96 | 96T |
全能核酸酶（M級(jí)）檢測(cè)試劑盒 | 36702ES48/96 | 48T/96T | |
耐高鹽全能核酸酶ELISA試劑盒 | 36703ES48/96 | 48T/96T | |
其他蛋白殘留檢測(cè) | Protein A ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36716ES48/96 | 48T/96T |
BSA牛血清白蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36722ES96 | 96T | |
T7 RNA聚合酶ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36705ES48/96 | 48T/96T | |
無機(jī)焦磷酸酶ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36706ES48/96 | 48T/96T | |
鼠源RNase抑制劑ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36707ES48/96 | 48T/96T | |
牛痘病毒加帽酶ELISA檢測(cè)試劑盒 | 36709ES48/96 | 48T/96T | |
RNase/DNase殘留檢測(cè) | RNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法） | 41309ES96/97 | 1×96T/5×96T |
DNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法） | 41322ES48/68 | 48T/192T |
