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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用EGFP標(biāo)記了的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。

其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲\氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲\氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI則被排除在活細(xì)胞（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V⁺/PI^-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被EGFP和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V⁺/PI⁺）。

本試劑盒需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20 ℃避光長期保存，避免反復(fù)凍融，一年有效。

【注】：如果需要在短時(shí)間內(nèi)多次重復(fù)使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效。

注意事項(xiàng)

1）由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。

2） 對于貼壁細(xì)胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰\酶消化時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時(shí)間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲\氨酸與Annexin V-EGFP的結(jié)合。消化時(shí)將胰\酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰\酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰\酶，利用剩余的少量胰\酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

3） 實(shí)驗(yàn)中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測凋亡的同時(shí)檢測細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因?yàn)樵诠潭ㄟ^程中EGFP會變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用Binding Buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因?yàn)楣潭ㄟ^程中細(xì)胞通透性增加會產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

4）如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴?/span>PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢允褂煤?/span>EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

5）試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

6）Annexin V-EGFP和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請注意避光。

操作方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

空白管：陰性對照細(xì)胞，不加Annexin V-EGFP和 PI Staining Solution ，用于調(diào)節(jié)電壓。

單染管：陽性對照細(xì)胞，只加Annexin V-EGFP，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

檢測管：處理的細(xì)胞，加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution。利用空白管和單染管調(diào)節(jié)好的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得。

1.1 樣品染色

1）懸浮細(xì)胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞；

  貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰\酶消化后，300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。胰\酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性；

2）用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min；

3）用1×Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1~5×10⁶/mL；

4）取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL的流式管中，加入5 μL Annexin V-EGFP，混勻后于室溫避光孵育5 min；

5）加入10 μL PI Staining Solution，并加400 μLPBS，立刻進(jìn)行流式檢測。

【注】：用流式檢測凋亡時(shí)，PI受時(shí)間的影響很大，時(shí)間過長會導(dǎo)致PI的染色增加，所以需要在1 h內(nèi)完成流式檢測。

1.2流式細(xì)胞儀分析

EGFP大激發(fā)波長為488 nm，大發(fā)射波長為507 nm；PI-DNA復(fù)合物的大激發(fā)波長為535 nm，大發(fā)射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），EGFP為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。每個樣采集10，000 events。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

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             HB200309