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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 1 mL |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11205ES03 | 應用領域 | 生物產業(yè) |
產品介紹
Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Hieff UNICON® qPCR實時熒光定量預混液(Probe Master Mix) | 11205ES03 | 1 mL | 225.00 |
Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix | 11205ES08 | 5 mL | 740.00 |
Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix | 11205ES25 | 25 mL | 3143.00 |
產品描述
qPCR實時熒光定量預混液(Probe Master Mix)是探針法2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。采用的抗體法熱啟動UNICON® DNA聚合酶（貨號：10113ES）可以有效抑制引物非特異性退火導致的擴增。同時，配方優(yōu)化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內獲得良好的標準曲線。
產品組分
組分編號 | 組分名稱 | 產品編號/規(guī)格 | ||
11205ES03（1 mL） | 11205ES08（5 mL） | 11205ES25（25 mL） | ||
11205-A | 2×Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix | 1 mL | 1 mL × 5 | 25 mL |
11205-B | 50×Low Rox | 40 μL | 200 μL | 1 mL |
11205-C | 50×High Rox | 40 μL | 200 μL | 1 mL |
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。本品避免反復凍融。建議分裝保存。
反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2×Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 1 | 0.2 μM |
TaqMan Probe (10 μM) | 0.2 | 0.5 | 0.1 μM |
50×High or Low Rox | 0.4 | 1 | 1× |
模板DNA | X | X | - |
無菌超純水 | to 20 | to 50 | - |
【注】： 使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 參比染料：Rox的添加，可根據不同儀器型號進行選擇，具體可參考【適用機型】。
b) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
c) 探針濃度：探針終濃度在50 nM-250 nM之間。
d) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
e) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，*模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。
f) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
g) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
擴增程序 （兩步法程序）
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數 |
預變性 | 95℃ | 1 min | 1 |
變性 | 95℃ | 10 sec | |
退火、延伸 | 60℃ | 30 sec | 40 |
【注】 a) 預變性時間：根據不同模板和引物的具體情況可適當增加預變性時間至3 - 5 min。
b) 退火溫度和時間：建議在56-64℃范圍內調整。如果反應效果不好，可以適當延長反應時間。
c) 熒光信號采集：請參考儀器設置。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。
反應結束后需要確認擴增曲線。進行PCR定量時，需要制作標準曲線。
反應特異性需要瓊脂糖凝膠電泳確認。
引物設計指南
1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp內選擇。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端后一個堿基為G或C。
4）引物內部或者正反兩條引物間避免出現有3個堿基以上的互補序列。
5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
TaqMan 探針設計指南
1）探針長度一般為18-40 bp。探針序列應盡量接近正向或者反向引物，但不能與之有重合區(qū)域。
2）探針的退火溫度應為 65-67℃。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現連續(xù)的4個相同堿基。探針5’端應避免使用堿基G。
4）若序列中包含多態(tài)性位點，應使其位于探針序列中間。
適用機型
High Rox適用機型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™;
Low Rox 適用機型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™6,7,12k Flex;
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;
不需要Rox校正的儀器型號：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™;
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000;
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96;
Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR.
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