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GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit
GMyc-PCR支原體檢測試劑盒
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原體檢測試劑盒 | 40601ES10 | 10 assays | -20℃ | 1120.00 | 327.00 |
40601ES20 | 20 assays | -20℃ | 1764.00 | 557.00 |
產品描述
細胞培養(yǎng)是生命科學研究中常用的實驗手段。不像其它常用的實驗方法，細胞培養(yǎng)是一個動態(tài)的連續(xù)過程，細胞通常會對操作失誤或污染物有所反應，這些反應往往表現(xiàn)出不正常的細胞狀態(tài)或培養(yǎng)基外觀。如果受到支原體污染時，細胞形態(tài)較之無明顯變化，極易被忽視，往往直到污染非常嚴重時才能發(fā)現(xiàn)。受污染的細胞膜上可能有幾百個支原體，這些支原體競爭營養(yǎng)并釋放有毒的代謝產物，嚴重影響實驗結果。
研究表明，至少二十多種支原體能污染細胞，其中zui常見的有：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）、發(fā)酵支原體（M. fermentans）、人型支原體（M. hominis）、唾液支原體（M.salivarium）、肺支原體（M.pulmonis）和梨支原體（M.pirum）等。培養(yǎng)細胞的支原體污染率在4%-92%不等，其污染來源包括工作環(huán)境、操作者本身（一些支原體是人體的正常菌群）、培養(yǎng)基、血清、細胞交叉污染、實驗器材和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。
確認細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)問題的潛在原因是一項困難且耗時的任務，在細胞培養(yǎng)中，任何突然的變化都應該被懷疑，同時良好的試驗規(guī)范和定期檢測支原體污染也十分必要。支原體檢測的方法有很多種，如直接培養(yǎng)、DNA熒光染色、ELISA和PCR法等。
GMyc-PCR支原體檢測試劑盒主要采用PCR方法對各種生物材料（如細胞培養(yǎng)物、實驗動物分泌物、動物血清等）支原體感染的檢測。它綜合了幾個優(yōu)勢：靈敏、特異、快速并且可以用直接用細胞培養(yǎng)上清液檢測。本制品通過PCR方法檢測培養(yǎng)細胞等生物材料中的支原體，所用引物為根據支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設計，只特異性擴增支原體DNA，檢出靈敏度與特異性均較高。PCR擴增及電泳分析只需數個小時，操作方便簡單。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號/規(guī)格 | |
40601ES10 | 40601ES20 | ||
40601-A | GMyc-1st PCR Mix | 250µl | 2×250µl |
40601-B | GMyc-2nd PCR Mix | 250µl | 2×250µl |
40601-C | Positive Control Template注1，2 | 20µl | 20µl |
【注1】：長期不用時，可-80℃冷凍保存。
【注2】：PCR反應極其靈敏，為防止假陽性，加樣時，zui后加陽性對照。
運輸與保存方法
冰袋運輸。-20℃保存。
實驗流程
此PCR反應為巢式PCR，*輪PCR結束后，取其反應產物為第二輪PCR模板。根據兩輪PCR產物電泳條帶之有無及片
段大小來分析結果。貼壁細胞培養(yǎng)3-6天后，直接取其上清液進行PCR反應。為排除細胞培養(yǎng)基抑制PCR反應，陽性對照中需加入等量的細胞上清液。懸浮細胞不能作為樣品直接檢測，會干擾PCR反應，需提取DNA并進行PCR。
*輪PCR：
1. 充分融解GMyc-1st PCR Mix，按下列表格配制反應液：
試劑 | 實驗組 | 陽性對照 | 陰性對照 |
GMyc-1st PCR Mix | 25µl | 25µl | 25µl |
樣品 | 4µl | 4µl | |
ddH2O | 21µl | 20µl | 25µl |
Positive Control Template注1 | 1µl |
【注】：為防止Positive Control Template污染，請將實驗組和陰性對照組加完以后，zui后再將Positive Control Template加入陽性對照組。
2. 按下列條件進行PCR反應：
94℃ 5 min
94℃ 30 s
58℃ 1 min 30~35 cycles
72℃ 1 min
72℃ 7 min
第二輪PCR：
1. 充分融解PCR Mix，按下列表格配制反應液：
試劑 | 實驗組 | 陽性對照 | 陰性對照 |
GMyc-2nd PCR Mix | 25µl | 25µl | 25µl |
ddH2O | 24µl | 24µl | 24µl |
1st PCR反應液1st PCR反應液（1000倍稀釋液）* | 1µl | 1µl | 1µl |
【注】*: *輪PCR反應液需經1000倍稀釋后方可用于第二輪PCR模板。
2. 按下列條件進行PCR反應：
94℃ 5 min
94℃ 30 s
58℃ 1 min 30~35 cycles
72℃ 1 min
72℃ 7 min
反應結束后，取10 μl 的PCR反應液（不需要加loading buffer）直接進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產物。
推薦使用頻率
新細胞進入實驗室 | 必檢 |
液氮保存前 | 必檢 |
定期常規(guī) | 每月檢測一次 |
發(fā)現(xiàn)污染后 | 每周檢測一次 |
發(fā)現(xiàn)細胞異常 | 隨時檢測 |
注意事項
1）使用本試劑前請仔細閱讀本說明書全文。
2）操作時應盡量少說話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性；整個檢測過程中，反應體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴增應分區(qū)域進行，以避免交叉污染。
3）實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應充分融化并混勻（混勻時禁止激烈振蕩，只需要進行上下倒置多次進行混勻）。
4）反應管中加好所有的試劑后，應盡快上PCR儀進行擴增，以免形成過多的二聚體。
5）細胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會影響本品的檢測結果。如果用戶需要進一步提高檢測靈敏度，建議細胞在不含青霉素和鏈霉鏈等抗生素中進行培養(yǎng)2-3天后送樣檢測。
6）為了您的健康，實驗操作時請穿實驗服和帶一次性手套。
附錄
各種支原體擴增片段大小
Species | *輪PCR | 第二輪PCR |
M. hyopneumoniae | 681 | 237 |
M. neurolyticum | 501 | 196 |
M. fermentans | 491 | 195 |
M. pulmonis | 477 | 189 |
M. hyorhinis | 448 | 211 |
M. orale | 423 | 179 |
M. capricolum | 415 | 179 |
M. arthritidis | 408 | 157 |
M. salivarium | 403 | 151 |
M. hominis | 370,369 | 147,148 |
M. arginini | 369 | 145 |
U. urealyticum | 482,481 | 154 |
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