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Hieff Trans^TM in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent

Hieff Trans^TM siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Trans^TM siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑是一種非脂質(zhì)體PEI陽(yáng)離子、兩性分子轉(zhuǎn)染試劑，為siRNA轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而開(kāi)發(fā)。適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。這種轉(zhuǎn)染試劑包裹siRNA或miRNA形成陽(yáng)離子復(fù)合物，該復(fù)合物與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白聚糖相互作用吸附在細(xì)胞表面，通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用，能夠吸收溶酶體中的H⁺，質(zhì)子的不斷流入，導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

該產(chǎn)品可在廣泛的細(xì)胞系中，實(shí)現(xiàn)1 nM的siRNA超過(guò)90%的表達(dá)效率，避免了脫靶效應(yīng)。適用于多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等貼壁細(xì)胞；以及難以轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞系，如K562或THP-1細(xì)胞，可達(dá)到80%的沉默效率；同時(shí)還包括一些原代細(xì)胞，原代人成纖維細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞等，可達(dá)到80%的沉默效率。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品4 oC保存，一年有效。不可冷凍！

注意事項(xiàng)

1）整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用無(wú)RNA酶和無(wú)熱原性的材料，如離心管、槍頭、緩沖液。

2）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA是經(jīng)過(guò)PAGE純化和脫鹽處理過(guò)的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

3）PEI陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該在4 oC保存，要注意避免多次反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)蓋，否則可能會(huì)導(dǎo)致PEI揮發(fā)，降低轉(zhuǎn)染效率。

4）轉(zhuǎn)染前一天，確保接種貼壁細(xì)胞密度在30%-50%左右，對(duì)于一些小細(xì)胞和生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，接種密度可適當(dāng)擴(kuò)大2倍。

5）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞活力。

6）該產(chǎn)品只適合體外轉(zhuǎn)染，不能用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

操作流程

一．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和轉(zhuǎn)染1 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請(qǐng)參考表1）
接種貼壁細(xì)胞

1.為了提高轉(zhuǎn)染效率，建議在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種細(xì)胞密度建議30%-50%左右，建議初次使用時(shí)設(shè)置梯度進(jìn)行優(yōu)化///佳使用量。

2.按照以下體系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)離復(fù)合物：

1）對(duì)于每孔細(xì)胞，使用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混勻。

2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的轉(zhuǎn)染試劑，旋渦10秒，充分混勻。

3）在室溫下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。
【注】：孵育時(shí)間不要超過(guò)30min

4）在形成復(fù)合物過(guò)程中，移除細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每孔中加入500 μL新鮮預(yù)熱的*培養(yǎng)基。

5）直接將100 µL siRNA-PEI陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細(xì)胞中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。終體積為600 µL ，siRNA終濃度為1 nM。

6）37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至目的基因表達(dá)。建議一般mRNA表達(dá)水平通常在24-72 h，蛋白表達(dá)水平在48-96 h。

圖1 轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞操作流程

【注】：由于靶基因、細(xì)胞類(lèi)型、siRNA效價(jià)、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉(zhuǎn)率等因素，均會(huì)影響siRNA的轉(zhuǎn)染效率。建議選取siRNA濃度在1 nM到10 nM之間。轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進(jìn)行調(diào)整，請(qǐng)參見(jiàn)下表1。

表1 siRNA終濃度為1 nM時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值

表2 siRNA終濃度為10 - 50 nM時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值

二．懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和轉(zhuǎn)染5 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請(qǐng)參考表4）
接種細(xì)胞

1.為了優(yōu)化懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，與貼壁細(xì)胞相比，需要降低懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基的體積。根據(jù)培養(yǎng)皿大小和完整培養(yǎng)基的體積，推薦的接種懸浮細(xì)胞的數(shù)量如下表3所示。

表3 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，根據(jù)培養(yǎng)皿的大小，接種懸浮細(xì)胞數(shù)量參考值

2.按照以下體系配制siRNA-PEI陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物：

1）對(duì)于每孔細(xì)胞，使用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋21 ng siRNA (1.5 pmols)，混勻。

2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的轉(zhuǎn)染試劑，立刻旋渦10秒，充分混勻。

3）在室溫孵育15 min，使得形成siRNA-PEI陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。
【注】：孵育時(shí)間不要超過(guò)30 min

4）在每孔200 μL細(xì)胞懸浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，輕輕混勻。終體積為300 µL，siRNA終濃度為5 nM。

5）37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h后，再加入700 µL*培養(yǎng)基，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板使其混勻。

6）繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育，直至目的基因表達(dá)。建議一般mRNA表達(dá)水平通常在24-72 h，蛋白表達(dá)水平在48-96 h。

【注】：為了優(yōu)化內(nèi)源性基因沉默，建議選取siRNA濃度在5 nM到20 nM之間。轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進(jìn)行調(diào)整，請(qǐng)參見(jiàn)下表4。

表4 siRNA濃度為5 nM時(shí)，在懸浮細(xì)胞中的參考值

表5 懸浮細(xì)胞中siRNA濃度、轉(zhuǎn)染試劑的用量參考值

三．miRNA轉(zhuǎn)染操作流程
該轉(zhuǎn)染試劑也適合轉(zhuǎn)染miRNA，轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的具體操作請(qǐng)參考siRNA的操作流程。

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HB200716