細胞株開發(fā)簡述：
可靠生產工藝的基礎
近年來，全球生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展正處于快速上升期，醫(yī)藥健康行業(yè)也將迎來新一輪的變革與機遇。其中，細胞與基因治療藥物、抗體藥物書寫創(chuàng)新生物藥新篇章，被認為是未來醫(yī)藥領域發(fā)展的主力軍。但無論是抗體藥物的生產還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備，都離不開穩(wěn)定高效的細胞株開發(fā)。
▲ Global Market Insights數據預測：CLD市場報告[1]
據Global Market Insights數據預測，CLD市場規(guī)模在2021年約為58億美元，預計從2022年到2028年將以每年約10.1%的復合年增長率增長，到2028年將達到約117億美元。
CLD作為生物藥CMC的起點和基礎，構建一個適合于生產的高表達穩(wěn)定細胞株至關重要，因為其在很大程度上決定了藥物開發(fā)的效率和成本。
CLD與古法造紙過程類似，成本昂貴、耗時長，開發(fā)流程如同雕版印刷中的勾刻印繪裱，每個步驟都涉及復雜而精細的生物分析和質量研究工作，并且需要優(yōu)化的細胞培養(yǎng)工藝，以確保能夠成功進行商業(yè)生產。
在CLD早期工藝開發(fā)階段增強對未來潛在挑戰(zhàn)的認識有助于降低失敗風險，減少重復工藝相關費用，并確保最終的生物藥滿足監(jiān)管要求。目前，CLD面臨著一些技術上的關鍵挑戰(zhàn)，例如大批量克隆篩選、早期表征分析和優(yōu)化以及可擴展性、細胞株穩(wěn)定性等。
面對不同的生物藥開發(fā)，如何實現高效、高質量的CLD？在工藝上又可以通過哪些手段或方案來滿足預期的商業(yè)化需求？下面就讓小編給大家細細道來。
不斷優(yōu)化的技術流程
自漢朝發(fā)明紙張以后，書寫材料比起過去用的甲骨、簡牘、金石和縑帛要更輕便、更經濟，但流程仍復雜，成本較高，雕版印刷技術的出現改變了這一現狀，標準化雕刻了反體字的模板與近乎透明的稿紙正面相貼，大大提升了原始手抄經書的速度，且筆畫清晰可辨。
目前CLD的標準流程步驟包括：基因克隆和初始克隆篩選、克隆篩選和驗證分析、細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化、評估和表征分析以及最后的細胞庫建立。整個開發(fā)周期一般需要12-18個月，對標準化流程中的每一步工藝改進都將影響CLD整體進程。
▲ 高效細胞株開發(fā)工藝流程
1、初始克隆篩選——全流程開發(fā)的基石
雕版印刷術的第一步是選擇合適的木板，厚度和硬度都是成功的關鍵屬性，而CLD的第一步需要考慮采用何種表達體系。
宿主細胞系直接影響產品的特定屬性，比如糖基化、羧基化、羥基化、酰胺化等；甚至還可能影響半衰期、免疫原性和生物學活性。宿主細胞系應有完整表征以及完整的記錄，并不含TSE/BSE等病毒污染因f素。另外，宿主細胞還應適合無血清培養(yǎng)基，或者無動物來源成分的培養(yǎng)基中懸浮生長。
近年來，隨著技術的發(fā)展以及研究的深入，有超過75.6%的生物藥采用哺乳動物細胞表達體系，其包括人源細胞和非人源細胞，其中在這部分里有超過83%的生物藥采用了非人源細胞系的CHO(Chinese hamster ovary)細胞進行CLD。
▲ 2014-2020年獲批的生物制劑應用的細胞表達體系比例
據統(tǒng)計，在2015年后獲批的藥物中，CHO細胞表達體系占據超過一半的比例。主要原因有三點：
CHO細胞在生物藥生產中應用早、表達量高、容易處理和操作以及法規(guī)接受程度高；
CHO細胞還具有較高的基因和表型不穩(wěn)定性，有著較多的細胞譜系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等；
致病性的病毒在CHO細胞中無法復制，因此CHO細胞被認為是非常安全的表達體系。
此外，初始克隆階段能夠以快速度鑒定細胞活力，從數以千計的克隆中找到穩(wěn)定、高產的克隆將為后續(xù)流程奠定基礎。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)采用生物層干涉（BLI）技術，是一種無標記的、實時監(jiān)測的技術，主要用于生物分子間相互作用動力學參數及蛋白濃度測定。使用Octet®，能夠對純化的樣品和異質的粗樣品裂解液中的IgG 濃度進行量化，最多可選96通道，10分鐘內檢測一塊384孔板。
2、目標蛋白表達——多方向考量與調整
從技術層面上分析，印刷術采用的字模材料主要是木和泥，經過多次使用，排字行距就變得歪斜不整齊。再加上本來字模手工雕刻導致的字體、大小、筆畫粗細不一，失誤導致的字體顛倒、錯字等，因此需要選擇合適的墨水和雕刻手法。
CLD的開發(fā)同樣如此，在選擇好合適的表達體系后，下一步的關鍵是讓核酸進入細胞并表達目的蛋白——轉染。
轉染是一種重要的重組DNA技術，其可將編碼目的蛋白產物基因與表達載體結合并插入細胞基因組。其中，載體是能夠自主復制的DNA元件。載體中不僅包含轉入的外源基因，還包括一些用于優(yōu)化蛋白質表達過程和緩解沉默效應的表達元件。選擇標記基因的主要目的是加快遺傳載體在宿主細胞系中的表達。用于CHO細胞的經典選擇標記包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）。
▲ 生物分子的表達載體和轉染流程（圖片來源：參考資料3）
目前轉染方法包括基于試劑的方法、基于儀器的方法和病毒介導法：
這里，應該注意的是，沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗，在選擇轉染方法時，需要考慮細胞類型、產品表達量需求、安全性、經濟性、工藝放大、周轉時間和法規(guī)要求等多方面因素。理想的方法應具有高轉染效率，低細胞毒性和對正常生理學的影響最小，并且易于使用和具有可重復性等特點。目前常用于哺乳動物細胞轉染的方法有磷酸鈣法、陽離子脂質體法、病毒轉染法和電穿孔法。
另外，在轉染過程中，化學限定的細胞培養(yǎng)基已經成為當下CHO細胞生產工藝的金標準。
在有關CHO培養(yǎng)基和克隆篩選方法的對比分析的研究中，研究人員運用培養(yǎng)基基準測試并充分利用Ambr® 15微型生物反應器平臺進行克隆/培養(yǎng)基各種組合的培養(yǎng)基篩選，在相同大小、多并行的生物反應器中比較培養(yǎng)物，建立多個實驗以評價不同的細胞系或克隆，并研究工藝參數的影響，例如溫度、補料、培養(yǎng)基成分、通氣量和接種密度。
并使用Octet®非標記分子互作分析系統(tǒng)對其進行滴度、結合活性以及糖基化分析等一系列檢測。
結果顯示結果顯示，4Cell® XtraCHO培養(yǎng)基，在細胞生長、存活率、產量、糖基化分析方面，性能優(yōu)于對照組培養(yǎng)基（詳見文章：高效細胞株開發(fā)：高通量細胞培養(yǎng)及滴度測定）。
3、細胞篩選和評估
雕版印刷肇始于隋，行于唐世，在不斷使用過程中人們逐漸發(fā)現其局限性，那就是發(fā)現錯別字時改起來很困難，常需整塊版重新雕刻，因此活字印刷術被發(fā)明，大大地加快了精準度和制版時間?，F代CLD細胞培養(yǎng)的過程中同樣能夠通過高通量分析和篩選技術精準、高效地發(fā)現目標細胞，并為下游工藝未雨綢繆。
通常，細胞轉染之后最終的生產克隆中會整合幾十到數千個目的基因拷貝，所以很難確定整合的質粒數是否可以達到預期的最佳值。而且，目的基因會選擇性標記在宿主細胞基因組中以隨機方式進行穩(wěn)定整合，故無法準確預測整合效果。因此，按照此流程選擇的Minipool實際上是異質的混合細胞群體，這些細胞在整合轉基因的數量和定位方面可能有明顯差異，故細胞比生產率（Qp）也可能各不相同。
為了提高高表達細胞出現的概率，可以采用“批量分揀法”富集穩(wěn)定高產的Minipool。由于早期Minipool的蛋白分泌較少，富集在上清里面的蛋白含量極低，故傳統(tǒng)方法在速度及數據準確度上都難以實現。
iQue®高通量流式細胞儀能夠快速監(jiān)測細胞健康和活力，使用人IgG滴度和活力分析試劑盒可以很好地評估懸浮CHO細胞，同時定量測定其分泌蛋白，以快速識別先導克隆，在短時間內增加克隆評估數量，5分鐘內完成一塊96孔板檢測。
ForeCyt®軟件上的Panorama功能具有動態(tài)多板數據分析能力，包括可以用戶自定義標準的圖譜，用于檢測和識別包含所需IgG同種型抗體濃度和細胞健康的樣品，這在多板篩選分析時非常重要。小鼠IgG亞型和產量檢測能夠簡化和加速抗體發(fā)現的工作流程，這意味著更短的時間獲得更多的分析結果。具體而言，將穩(wěn)定的Minipool與采用熒光標記的親和分子或特異性抗IgG抗體一起孵育，以表征細胞表面上分泌的重組蛋白量，從而能夠識別和富集高產Minipool。
由于監(jiān)管機構僅接受采用單克隆細胞生產生物藥，這意味著生產所用細胞必須是從單個細胞克隆而來的均一細胞，因此需要進一步對Minipool進行單克隆化和選擇適于大規(guī)模生產的克隆。
4、單細胞克隆
活字印刷術由于手工制作的原因，單字之間存在個體差異，經過篩選出來的Minipool同樣存在這類問題甚至更加嚴重，可能其中的每個細胞都具有特別的遺傳和表型特征。
單克隆性不足可能引發(fā)一些問題，例如：生長速率、代謝特征、重組蛋白Qp穩(wěn)定性、產品質量等方面的差異。若Minipool由生長速率（μ）和Qp有微小差異的細胞組成，則μ高的低產Minipool將逐漸在數量上超過μ低的高產細胞群。據報道，這種情況下僅9%的生長優(yōu)勢便足以使細胞在25代內出現過度增殖，這意味著工業(yè)生產必需采用基因和表型方面高度均一化的單克隆。
因此，需要采用先進的技術手段以該類Minipool的單個細胞為起點進行克隆，以確保生產用的所有細胞均來自單個細胞。對選定的Minipool進行克隆、培養(yǎng)和評估，在多次迭代選擇之后，最終的細胞庫由具有相同遺傳學特征的細胞（克隆群體）組成。目前，常用的細胞單克隆方法包括但不限于以下四種：傳統(tǒng)的有限稀釋法（LDC）、基于熒光激活細胞分選技術（FACS）、高通量自動化顯微技術、自動化克隆系統(tǒng)等。
作為LDC或FACS單細胞分選技術的主要替代方法，CellCelector平臺可實現高精度、高通量的單細胞及克隆篩選。通過結合高精度的機械臂技術及優(yōu)化的采集模塊，能夠自動進行排序及篩選，實現基于圖像的單克隆性證明和克隆活力評估，同時準確分離出完整的高活率單細胞、貼壁克隆等，提高CLD效率。
此外，因為涉及產品的安全性，細胞的單克隆源性驗證在確保生物制藥產品的純度和均一性上至關重要，因此FDA的政策和法規(guī)都強制要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據，用以證明單克隆生物藥研發(fā)過程中的單克隆源性。
▲ 克隆篩選（圖片來源：參考資料5）
另外，早期克隆篩選的通量很高，因此必須有一個運行非常平穩(wěn)和高效的優(yōu)化過程，包括細胞計數和滴度測定的適當方法，而這些方法都需與高通量兼容。這意味著必須確保篩選了足夠數量的克隆，才能得到真正想要的類型。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)不僅能夠快速定量粗提物中的蛋白，而且擁有針對檢測ProteinA、HCP殘留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商業(yè)試劑盒，用戶可以在早期CLD階段快速篩選出高質量細胞株，也可以在Octet®系統(tǒng)上輕松開發(fā)項目所需的高靈敏度定量分析方法。
接下來，完成克隆篩選后，需要進一步驗證生物藥產品的生物活性、功效及關鍵質量屬性（CQA），這些關鍵信息將為下一步實驗開展及工藝開發(fā)提供重要指導。Octet®分子互作分析系統(tǒng)可以進一步對生物藥產品的關鍵質量屬性（CQA）進行評價，得到優(yōu)單克隆細胞株。
5、細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)基優(yōu)化
挑選到理想的高表達克隆后，就要開始選擇商業(yè)化培養(yǎng)基或者定制培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)優(yōu)化。高通量、標準化、自動化的細胞培養(yǎng)和工藝優(yōu)化能幫助我們在獲得更準確結果的同時加速細胞株開發(fā)進度。
另外，在生物藥項目開發(fā)之初及時采用自動化和高通量平臺，還能以可追溯的方式簡化優(yōu)化策略，通過促進多個參數的平行評估，使得從研究規(guī)模到商業(yè)規(guī)模的條件保持一致，顯著提高細胞株開發(fā)效率。
傳統(tǒng)的搖瓶培養(yǎng)篩選方法，因為無法提供一個良好穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，導致工藝放大性差，頻繁出現錯篩和漏篩的情況，最終產生大量無效重復的工作，在一定程度上延長了CLD周期，Ambr®15高通量微型生物反應器系統(tǒng)，采用與玻璃罐反應器相似的物理設計以及配套的數據處理系統(tǒng)，可以高效準確獲取克隆的真實性能。
6、評估和表征分析
在整個生藥物開發(fā)過程中，應持續(xù)對抗體進行表征分析，以確保滿足生物安全法規(guī)，并確保產品的性能符合預期。
Octet®BLI系統(tǒng)作為高通量非標記分子互作平臺，不僅可以進行滴度檢測，還可以對抗體進行一系列的表征分析，提供詳細的表征分析說明書，加快藥物申報上市的速度。
除此之外，還需對所選細胞進行嚴格細致的測試，以保證其遺傳穩(wěn)定性，并確保其不含任何病原體及其它未知因子。
Summary
從雕版到活字，印刷術的發(fā)展為CLD流程開發(fā)提供了直接的經驗性啟示。未來仍需要在發(fā)展的過程中不斷優(yōu)化CLD的流程。除了采取不同的優(yōu)化策略，穩(wěn)定高效的CLD還需要開發(fā)更加先進設備。不久前，賽多利斯發(fā)布了有關CLD的白皮書，其概述了CLD工藝流程以及生物制藥公司在建立CLD流程時面臨的關鍵挑戰(zhàn)和優(yōu)化策略，以幫助有CLD需求的生物制藥公司了解更多工藝細節(jié)。
-參考文獻-
https://www.gminsights.com/industry-analysis/cell-line-development-market-report
https://www.researchgate.net/publication/291950333_Challenges_of_glycosylation_analysis_and_control_An_integrated_approach_to_producing_optimal_and_consistent_therapeutic_drugs
https://www.researchgate.net/publication/350861457_Recent_advances_in_CHO_cell_line_development_for_recombinant_protein_production
張愛龍《提升高產細胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細胞打印機（附案例分享）》
孤毒藥師《CMC基石：生物制劑生產中的細胞株開發(fā)流程》
Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol ??cki, Parrish Galliher. 2018
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