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做透Octet，發(fā)Nature！看看教科書級的實驗設計
如何評價一篇好文章？創(chuàng)新性和可信性才是關鍵標準，而非所用技術手段的復雜程度。近期，《Nature》發(fā)表的一篇文章，僅僅采用了兩種主要技術手段便一氣呵成。今天，就讓陳老師帶大家一探究竟。
人類免疫缺陷病毒（HIV）的感染是導致艾滋病的原因，HIV要實現(xiàn)復制和傳播，需要將遺傳物質傳遞到細胞核內并整合進染色體中。近日，馬克斯-普朗克研究所與麻省理工學院合作發(fā)表的一篇《Nature》文章[1]，揭示了HIV是如何進入核孔的。研究首先指向了核孔復合物（NPC），它由約30種不同的核孔蛋白（Nup）構建而成，其中包括約10種所謂的FG-Nup，它們將形成屏障的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重復結構域錨定到NPC支架上，呈凝膠狀，被稱為FG相（FG phase）。這種FG相填充在核孔中，通常只允許核轉運蛋白（NTR）通過，然而研究發(fā)現(xiàn)，HIV衣殼也可以滑過核孔的FG相。
圖1. NTR和HIV通過NPC示意圖
這篇發(fā)表在《Nature》雜志的文章所用的技術手段非常簡單，主要通過激光共聚焦對核膜與HIV進行共定位，并利用Octet®非標記分子互作分析系統(tǒng)檢測HIV衣殼蛋白CA和核孔蛋白（Nups）之間的分子相互作用。這兩種技術一表型功能，一內在機制，二者相輔相成。特別是Octet®系統(tǒng)的分子互作數(shù)據(jù)，占據(jù)了文章相當?shù)钠?/p>
該文中關于Octet®分子互作的實驗設計方案堪稱教科書級別，值得我們一同細細品味：
在Octet®實驗方法中，研究者們將來自五種不同Nups（Nup98、62、58、50和358）的八個FG結構域固定在鏈霉親和素傳感器上，將二硫鍵穩(wěn)定的CA六聚體作為分析物。
圖2.Octet®實驗方法示意圖
驗證Octet®實驗可行性之1
分析物陽參對照設置
importin β超家族的成員是最大的核轉運蛋白（NTR） 類，允許NTR及其貨物復合物以非常高的分配系數(shù)進入核膜，所以原則上NTR是與FG Nup結合的理想陽性對照。
圖3. Octet®結果顯示：分析物importin β可以和含有FG結構域的Nup結合，其親和力類似
驗證Octet®實驗可行性之2
固化物陽性對照和陰性對照設置
據(jù)文獻報道，CA可以和Nup153和CPSF6結合，所以Nup153和CPSF6可以成為良好的固化物的陽性對照。當然，與無關的固化物陰性對照Nesprin2沒有結合。
圖4. 左圖：固化物Nup153與分析物CA六聚體的結合
中圖：固化物CPSF6與分析物CA六聚體的結合
右圖：固化物Nesprin2與分析物CA六聚體的結合
可行性確認后，驗證CA六聚體與不同Nups的結合強弱及狀態(tài)。
CA六聚體可以與富含F(xiàn)G結構域的不同家族Nups快速動態(tài)結合，并且與分析物陽性對照Nup153和CPSF6親和力相似，也與importin β親和力相似。因此，CA六聚體可以廣泛的與FG重復序列的Nups結合。
圖5. CA六聚體與所有富含F(xiàn)G結構域的Nups結合，并且結合速率較快
結合特異性驗證（分析物陰性對照）
Octet®檢測發(fā)現(xiàn)FG結構域的Nups與CA-N57A突變（該突變會阻礙與Nup153和CPSF6的FG基序的相互作用）的親和力減弱。
圖6. 黑色虛線是突變體CA-N57A的親和力，與未突變相比，親和力大大降低。
基于生物層干涉技術的Octet®非標記分子互作系統(tǒng)是這篇《Nature》文章揭示分子機理的關鍵方法。一方面，因為在固化物和分析物上各種對照讓結果更可信外，另一方面還因為Octet®系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：
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非標記Direct binding是趨勢，結果更準確
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快速測定親和力，更加定量化地表征分子互作
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無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）；本文的分子互作的解離都比較快，用傳統(tǒng)的pull-down技術可能會被洗掉，導致假陰性結果
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寫入了美國藥典，文章多，認可度廣
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萬金油技術，可以用與檢測DNA，小分子，蛋白質等各種生物分子
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操作簡便，耗材及維護成本低
只要把Octet®做透，發(fā)好文章不是難題！
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《生物層干涉技術應用文集（第三版）》
《生物層干涉技術小分子應用文集》
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-參考文獻-
[1] HIV-1 capsids enter the FG phase of nuclear pores like a transport receptor.Nature,2024