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德國賽多利斯集團(tuán)>>技術(shù)文章>>BLI變身PLI? Octet又又又解鎖新應(yīng)用!

BLI變身PLI? Octet又又又解鎖新應(yīng)用!

閱讀:380        發(fā)布時(shí)間:2024-4-16

利用噬菌體病毒選擇性感染和殺死致病菌,稱為噬菌體療法。目前,噬菌體篩選的主要手段包括基于光學(xué)的測定,不能在復(fù)雜的介質(zhì)中進(jìn)行,如有色溶液、不均勻混合物或高粘度樣品。


為應(yīng)對這些挑戰(zhàn),研究人員采用基于生物層干涉技術(shù)(Biolayer interferometry,BLI)的Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng),建立了噬菌體層干涉術(shù)(Phage-layer interferometry,PLI)作為噬菌體伴隨診斷方法[1]。


PLI不僅為一種定量的噬菌體篩選方法,同時(shí)可以作為細(xì)菌檢測平臺。PLI易于自動(dòng)化,還可以在復(fù)雜、不透明的介質(zhì)中發(fā)揮作用,如嬰兒配方奶粉。PLI方法的建立,將對預(yù)防食源性疾病及對抗AMR(抗生素耐藥性)產(chǎn)生直接而廣泛的影響。那么,PLI技術(shù)又是如何誕生的呢?接下來讓我們一睹為快!

 

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圖1. PLI實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)菌結(jié)合和裂解:

第1步,baseline,緩沖液平衡;

第2步,噬菌體固化在Octet®傳感器上;

第3步,細(xì)菌結(jié)合;

第4步,緩沖液中解離

 

PLI方法開發(fā)

鑒于噬菌體T7展現(xiàn)出極高的治療潛力,研究者因此選擇其來合成噬菌體功能化的BLI傳感器,用作PLI噬菌體生物傳感器的原型。首先,將純化的T7進(jìn)行生物素化,并通過透析法去除多余生物素,然后T7-bio就可以固化在SA傳感器上。


 

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上圖:噬菌體生物素化示意圖;左圖:T7噬菌體固化的信號較高,說明其可以成功固化在SA傳感器上

圖2. T7噬菌體生物素化和傳感器固化示意圖

 


研究人員通過掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)一步確認(rèn)了傳感器表面的T7的功能化不受影響。固化后的噬菌體平均長度和直徑分別為85±15nm和66±11nm,與之前研究報(bào)道的3D 冷凍電子斷層掃描衍生模型計(jì)算出的尺寸非常吻合。由于Octet®傳感器是由玻璃光纖制成,可以在SEM下直接觀察。

 

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圖3. 固定化T7顆粒的代表性SEM圖像與冷凍電子斷層掃描3D模型的比較

 

PLI方法評估

噬菌體宿主范圍篩選:將T7傳感器浸沒在細(xì)菌肉湯培養(yǎng)物中并通過PLI信號隨時(shí)間的變化來研究噬菌體-宿主動(dòng)力學(xué)。通過BW25113(敏感菌株)和BW25113 ΔwaaCΔtrxA(耐藥菌株)進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)BW25113與T7傳感器的結(jié)合信號更強(qiáng),并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)確認(rèn)了PLI良好的重復(fù)性。這一發(fā)現(xiàn)證明PLI在研究噬菌體宿主范圍時(shí)可通過比較噬菌體結(jié)合能力參數(shù)進(jìn)行篩選。

 

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圖4.細(xì)菌結(jié)合的PLI信號:BW25113(敏感菌株)PLI信號比BW25113 ΔwaaCΔtrxA(耐藥菌株)高

 

量化噬菌體感染參數(shù)(如宿主結(jié)合和潛伏期):細(xì)菌結(jié)合后將傳感器洗滌并在LB中孵育測量裂解動(dòng)力學(xué)。由于細(xì)菌解離,BW25113和BW25113ΔwaaCΔtrxA前期檢測信號略有下降。120分鐘后,BW25113信號急劇增加后迅速降低,表明噬菌體感染引起細(xì)菌腫脹后裂解(劃重點(diǎn)!在解離觀察到信號起伏就說明細(xì)菌被噬菌體裂解了?。6鳥W25113ΔwaaCΔtrxA沒有產(chǎn)生“裂解”信號??紤]到PLI是實(shí)時(shí)的檢測,所以在PLI中可觀察到單個(gè)感染周期,因此可以推斷噬菌體潛伏期,T7在室溫下的潛伏時(shí)間為193 ± 26分鐘。通過PLI測定潛伏期與傳統(tǒng)方法相比操作更為簡單。

 

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圖5.在解離步驟中,PLI發(fā)現(xiàn)BW25113細(xì)菌裂解

 

研究人員還通過SEM確認(rèn)了傳感器的細(xì)菌裂解碎片上覆蓋著T7(白色顆粒),從而證實(shí)噬菌體傳感器誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解。

 

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圖6. 傳感器表面上細(xì)菌裂解和裂解產(chǎn)物的代表性圖像:C圖為菌體開始裂解,但是菌體相對完整;D,E圖為裂解后的細(xì)菌,并附著噬菌體

 

PLI實(shí)戰(zhàn)1—能被噬菌體裂解的細(xì)菌篩選

研究人員使用ECOR集合(該集合包括來自世界各地的大腸桿菌菌株)中的30種細(xì)菌篩選T7宿主范圍,并與傳統(tǒng)的噬菌體篩選方法DLA(雙瓊脂覆蓋試驗(yàn))進(jìn)行對比。結(jié)果顯示PLI比傳統(tǒng)方法具有更高靈敏度,如ECOR-16在DLA測定中未被確定為敏感,但在PLI檢測中觀察到裂解信號后,重新分析DLA培養(yǎng)皿,可在最濃縮的稀釋度下顯示出小斑塊??梢?,PLI測量噬菌體宿主范圍的能力更強(qiáng),并易于比較噬菌體感染參數(shù)如宿主結(jié)合動(dòng)力學(xué)和潛伏期,從而實(shí)現(xiàn)更標(biāo)準(zhǔn)化的噬菌體候選物篩選過程。

 

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圖7. PLI檢測ECOR集合中 30 種菌株的結(jié)合和裂解

 

PLI實(shí)戰(zhàn)2—奶粉中診斷細(xì)菌

由于噬菌體通過結(jié)合細(xì)菌來診斷細(xì)菌的存在,而Octet®具有在復(fù)雜樣品中檢測的能力,因此研究人員將PLI用于檢測嬰兒配方奶粉的細(xì)菌污染。嬰兒配方奶粉是不透明的,很難通過傳統(tǒng)的光譜方法進(jìn)行分析。將T7生物傳感器浸入嬰兒配方奶粉中檢測,與未污染的奶粉相比受污染的奶粉的結(jié)合信號更高。在LB培養(yǎng)基中解離,觀察到受污染的奶粉檢測信號存在裂解特征,未污染的奶粉僅顯示非特異性結(jié)合分子從傳感器表面的解離信號。

 

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圖8. ?PLI檢測污染的嬰兒配方奶粉:左圖,在奶粉中,噬菌體結(jié)合細(xì)菌PLI信號;右圖,在LB培養(yǎng)基中解離,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的裂解信號

Octet®還提供其他配套的傳感器固化病毒,比如本文還用AR2G(氨基偶聯(lián))傳感器結(jié)合帶正電荷的聚乙烯亞胺(PEI)聚合物,再捕獲與噬菌體結(jié)合的細(xì)菌,并進(jìn)行檢測,其結(jié)果與生物素化后固化在SA傳感器結(jié)果類似。

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以上就是BLI變身PLI的全過程,PLI之所以適合于復(fù)雜樣本檢測以及長時(shí)間(400-500mins)細(xì)菌裂解動(dòng)力學(xué)監(jiān)測,主要得益于Octet®技術(shù)特點(diǎn),浸入即讀的模式可以使檢測樣本不受限制,無流路的限制可以在長時(shí)間檢測時(shí)節(jié)省大量樣本!

 

除了以上優(yōu)勢Octet® BLI還具備以下特點(diǎn):


  • 非標(biāo)記Direct Binding是趨勢,不需要標(biāo)記和信號放大,可以更好的保持反應(yīng)物的活性

  • 快速測定親和力,提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作

  • 無洗滌步驟,可測弱親和力(解離快)

  • 寫入了美國藥典,文章多,認(rèn)可度廣

  • 萬金油技術(shù),可以用與檢測小分子,蛋白質(zhì)等各種生物分子,還可以檢測細(xì)菌,噬菌體等

  • 操作簡便,耗材及維護(hù)成本低

 

 

-參考文獻(xiàn)-

[1] Needham, P., Page, R. C., & Yehl, K. (2024). Phage-layer interferometry: a companion diagnostic for phage therapy and a bacterial testing platform. Scientific reports, 14(1), 6026. https://doi.org/10.1038/s41598-024-55776-1

 

 

 

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