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iPSC維持、培養(yǎng)要求高？表征困難？這些研究方法幫你解決
誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）下文簡稱iPSC，是指通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。iPSC在2006年日本科學家山中申彌的實驗中誕生，從全球來看，已有多款iPSC細胞治療產品處于臨床研究階段。
近年來，細胞療法在癌癥治療領域取得了豐碩的結果，但免疫細胞療法不管是在血液瘤還是實體瘤領域都面臨著細胞來源不足或質量不均的問題，iPSC衍生的細胞成為了一種好的選擇。iPSC逐步成為細胞治療領域的重要臨床研發(fā)方向。
下面給大家來介紹在iPSC維持、培養(yǎng)和表征過程中有哪些好用的方法和工具：
iPSC分離挑取
iPSC在維持和培養(yǎng)過程中一致性和可重復性的數據至關重要，手動挑取iPSC可能產生更多的陽性細胞，在干細胞集落的分離轉移過程中也相當有挑戰(zhàn)。這時候一臺快速、溫和的全自動無損細胞分離系統(tǒng)就可以滿足您的需求，CellCelector Flex具有專門為貼壁細胞和細胞克隆設計的挑取模塊，能夠溫和且高度特異性地分離靶細胞，非常適合分離單個干細胞、干細胞集落并進行傳代，并且能夠分離干細胞集落的特定部分?？勺畲蟪潭忍岣咚暨x的干細胞克隆的存活率和克隆性，同時保持其多功能性特征。
圖1. 使用 CellCelector Flex 可以精準、快速、溫和且可靠地挑取 iPSC。
使用 CellCelector 平臺拍攝的顯微照片，照片中突出顯示了系統(tǒng)選擇的 iPSC 集落。(A) 和 (B) 分別為手動和 CellCelector 挑取并接種的 iPSC 集落，用碘化丙啶 (PI) 染色以鑒別死亡細胞。顯微照片 (C) 顯示了 CellCelector 挑取之前，干細胞集落中的一個分化區(qū)域。(D) 是 (C) 中所示的培養(yǎng)板區(qū)域分離分化部分后的顯微照片。(E) 是挑取多能細胞部分之前，飼養(yǎng)細胞層上生長的大型 iPSC 集落的顯微照片。集落右下角有自發(fā)分化的跡象。(F) 是使用 CellCelector Flex 挑取 (E) 中的集落后的顯微照片，CellCelector靶向收集并轉移了多能細胞區(qū)域用于進一步培養(yǎng)。比例尺等于 500 µm。
iPSC生長監(jiān)測
而在 iPSC 培養(yǎng)過程中監(jiān)測形態(tài)和多能潛力又是另一個挑戰(zhàn)，如何能直觀的監(jiān)測脆弱的iPSC細胞培養(yǎng)物？這時候Incucyte® 實時活細胞分析平臺就體現(xiàn)出了它特有的優(yōu)勢，在您的實驗中，無需從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板即可監(jiān)測脆弱的 iPSC 細胞系培養(yǎng)物的形態(tài)和生長特征。下面讓我們來看看實際案例中，Incucyte®是如何發(fā)揮它的作用的：
使用 Incucyte Cell-by-Cell貼壁細胞模式在10x放大倍數下掃描其形態(tài)差異并自動進行定量分析。通過 Basic Analyzer 和 AI 活細胞匯合度分析測定細胞核和細胞質面積（圖 3C和F），然后按以下公式計算核質比（研究 iPSC 的標準測量值）：
圖2. 在 iPSC 培養(yǎng)過程中監(jiān)測形態(tài)和多能潛力。
在優(yōu)化 (mTESR Plus) 和未優(yōu)化 (RPMI) 條件下生長的 iPSC 的 Incucyte® 圖像。（A、D）經 Nuclight 快速紅色染料染色后的 iPSC 熒光圖像，比較了不同條件下的細胞核密度。（B、E）相同 iPSC 的相差圖像，顯示出兩個變量之間的形態(tài)差異。（C、F）Incucyte® 上的圈描分析顯示了匯合度和核熒光面積，可用于確定核質比，如 (G) 中所示。比例尺等于 400 µm。
iPSC功能表征
最后在細胞表征過程中，同樣可以用到賽多利斯iQue® 流式細胞儀 表征珍貴細胞類型，每個樣品僅需 10 µL，充分節(jié)省樣品以滿足下游需求，同時ForeCyt軟件比起傳統(tǒng)流式更簡單，是高通量流式篩選常用儀器。下面讓我們看看iQue® 是如何在iPSC表征中發(fā)揮作用的吧：
圖3. 使用 iQue® 高通量流式細胞儀分析 iPSC 標記物表達的變化。
iQue Forecyt® 軟件收集的 iPSC 生長數據的散點圖，iPSC 分別在優(yōu)化培養(yǎng)基 (mTESR Plus) 和未優(yōu)化培養(yǎng)基 (RPMI) 中培養(yǎng)了 (A) 2 天和 (B) 4 天，誘導“分化”。圖中顯示了 SSEA-1（非多能性標記物）、SSEA-4（多能性標記物）、TRA-1-60（多能性標記物）和“多能性”（SSEA-1 陰性，SSEA-4/TRA-1-60 陽性）的標記物表達量（± SEM，n=4）。圖 (C) 顯示了iQue Forecyt®軟件所呈現(xiàn)的 SSEA-1 和“多能性”標記物原始數據，數據采集自優(yōu)化和未優(yōu)化條件下生長 2 天的 iPSC (n=4)。NCCIT 和 THP-1 分別是多能性標記物表達和非多能性標記物表達的對照細胞系。
使用三種賽多利斯儀器（CellCelector Flex，Incucyte® 和 iQue®）挑取和接種 iPSC、測定多能性并監(jiān)測細胞生長情況和匯合度。自動化、靈活的工作流程讓您的iPSC培養(yǎng)和表征不再困難。
