上海信帆生物供應(yīng)：一氧化氮（NO）含量測(cè)定試劑盒！

一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。
測(cè)定原理：
NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO2—，在酸性條件下，NO2—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個(gè)樣品需做對(duì)照管。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體3mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。
測(cè)定步驟和操作表：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm。
2、操作表
對(duì)照管
測(cè)定管
樣品（μL）
100
100
試劑一（μL）
50
試劑二（μL）
50
試劑三（μL）
50
50
混勻，4℃室溫靜置15min，于微量石英比色皿/96孔板，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定550nm處吸光值，記為A550。
NO含量計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R2= 0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2— ，相當(dāng)于1μmoL NO。
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
NO含量（μmoL/g）=（A550 +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10-3
= 0.125×（A550 +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO含量（μmoL/mg prot）=（A550 +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣×Cpr）×10-3
= 0.125×（A550 +0.0103）÷Cpr
2、其他樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每升樣品15min生成1μmoL NO2— ，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量（μmoL/L）=（A550 +0.0103）÷0.016×V反總÷V樣
= 125×（A550 +0.0103）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103，R2= 0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2— ，相當(dāng)于1μmoL NO。
（1）按樣本重量計(jì)算
NO含量（μmoL/g）=（A550 +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10-3
= 0.25×（A550 +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO含量（μmoL/mg prot）=（A550 +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣×Cpr）×10-3
= 0.25×（A550 +0.0103）÷ Cpr
2、細(xì)胞
NO含量定義：25℃時(shí)，每104 個(gè)細(xì)胞15min生成1μmoL NO2— ，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量（μmol/104 cell）=（A550 +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×10-3
= 0.25×（A550 +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
3、 其他樣品：
NO含量定義：25℃時(shí)，每升樣品15min生成1μmoL NO2— ，相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量（μmoL/L）=（A550 +0.0103）÷0.008× V反總÷V樣= 250×（A550 +0.0103）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒2-8℃保存。
2. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)，試劑三有腐蝕性，操作時(shí)請(qǐng)做好防護(hù)措施。
3. 若檢測(cè)出得OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外，請(qǐng)將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋，并在計(jì)算公式中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。
4. zui低檢出限為0.65μmoL/L。