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PCR常見問(wèn)題及解決方案
問(wèn)題 | 可能原因 | 解決方法 |
無(wú)產(chǎn)物或產(chǎn)量低 | 模板濃度偏低或偏高 | 電泳檢測(cè)模板濃度，調(diào)整模板用量 |
模板降解 | 重新制備；基因組DNA、cDNA應(yīng)小量分裝后低溫保存 | |
模板中含有抑制反應(yīng)的雜質(zhì) | 純化模板 | |
引物濃度不足 | 調(diào)整引物濃度，特別是針對(duì)長(zhǎng)片段PCR | |
引物存在二級(jí)結(jié)構(gòu) | 重新設(shè)計(jì)引物，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)；優(yōu)化退火溫度 | |
引物降解 | 引物應(yīng)高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復(fù)凍融 | |
Mg2+濃度偏低 | 適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對(duì)不同模板和引物摸索佳Mg2+濃度 | |
dNTP降解 | -20℃保存，小量分裝，避免反復(fù)凍融 | |
酶純度低，擴(kuò)增效率差 | 選用高質(zhì)量DNA聚合酶 | |
酶量不足 | 適當(dāng)增加酶量 | |
用酶不當(dāng) | 針對(duì)模板、目標(biāo)片段的特選擇適當(dāng)?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南) | |
緩沖液失效 | 更換緩沖液或使用預(yù)混PCR反應(yīng)體系 | |
模板變性不充分 | 適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間；對(duì)高GC或復(fù)雜結(jié)構(gòu)模板，提高起始變性溫度至98℃ | |
退火溫度偏高 | 降低退火溫度，應(yīng)比引物Tm低至少5℃ | |
延伸時(shí)間不足 | 增加延伸時(shí)間，特別是針對(duì)長(zhǎng)片段PCR | |
循環(huán)數(shù)目不夠 | 增加循環(huán)數(shù) | |
PCR管污染 | 質(zhì)量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應(yīng)先高溫高壓滅菌處理；用過(guò)的PCR管不可清洗后重復(fù)使用 | |
PCR儀故障 | 檢查程序和模塊溫度 | |
其他 | 使用PCR增強(qiáng)劑 | |
非特異產(chǎn)物過(guò)多 | 體系污染 | 設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)尋找污染源，操作時(shí)應(yīng)注意避免交叉污染 |
引物濃度過(guò)高 | 適當(dāng)減少引物濃度 | |
引物序列特異性差 | 重新設(shè)計(jì)引物 | |
Mg2+濃度過(guò)高 | 降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對(duì)不同模板和引物摸索佳Mg2+濃度 | |
dNTP濃度過(guò)高 | 降低dNTP濃度 | |
酶量過(guò)多 | 減少酶量，以0.5 U間隔遞減 | |
退火溫度過(guò)低 | 提高退火溫度 | |
延伸時(shí)間過(guò)短 | 增加延伸時(shí)間，以1 min間隔遞增 | |
循環(huán)次數(shù)過(guò)多 | 減少循環(huán)次數(shù) | |
模板結(jié)構(gòu)過(guò)于復(fù)雜或目標(biāo)片段過(guò)長(zhǎng) | 特選擇適當(dāng)?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南)；使用PCR增強(qiáng)劑 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
引物二聚體 | 引物3’末端存在互補(bǔ)序列 | 重新設(shè)計(jì)引物 |
引物濃度過(guò)高 | 降低引物濃度 | |
模板濃度過(guò)低 | 提高模板濃度 | |
退火溫度不合適 | 優(yōu)化退火溫度 | |
循環(huán)次數(shù)過(guò)多 | 減少循環(huán)次數(shù) | |
其他 | HotStart PCR | |
拖尾嚴(yán)重 | 引物濃度過(guò)高 | 調(diào)整引物濃度 |
引物序列特異性差或模板上存在同源序列 | 重新設(shè)計(jì)引物 | |
模板降解 | 重新制備模板 | |
模板濃度過(guò)高 | 降低模板濃度 | |
dNTP濃度過(guò)高 | 減少dNTP用量 | |
Mg2+濃度過(guò)高 | 降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對(duì)不同模板和引物摸索佳Mg2+濃度 | |
酶量過(guò)多或質(zhì)量差 | 減少酶量，以0.5 U間隔遞減；更換質(zhì)量可靠的酶 | |
變性溫度過(guò)低 | 提高變性溫度，以0.5℃遞增 | |
退火溫度過(guò)低 | 提高退火溫度 | |
延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 縮短延伸時(shí)間 | |
循環(huán)次數(shù)過(guò)多 | 減少循環(huán)次數(shù)，以2個(gè)循環(huán)間隔遞減 | |
體系污染 | 設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，消除污染源 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
假陽(yáng)性 | 目標(biāo)片段與非特異擴(kuò)增片段間存在同源性 | 設(shè)計(jì)陰性對(duì)照，確認(rèn)為引物問(wèn)題后重新設(shè)計(jì)引物 |
體系污染 | 設(shè)計(jì)陰性對(duì)照判斷是否有污染，去除污染源 |