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基因擴增的基本要素及PCR基因擴增儀的三步基本反應
基因擴增的基本要素及PCR基因擴增儀的三步基本反應
1、基因擴增的基本要素
基因擴增的基本要素與DNA復制的基本要素是一致的。
①DNA模板：待拷貝的DNA稱為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，后擴增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。
?、谝铮菏荄NA復制的先鋒，就象結(jié)晶過程中的晶核，引導DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
?、跠NA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA復制的動力，在dNTP等底物存在時在引物的引導下沿著模板DNA合成互補的DNA鏈。
④緩沖液：提供DNA合成反應所需的pH，離子強度等環(huán)境。
?、?種單核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。
2、基因擴增儀原理
基因擴增儀是利用PCR技術對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。
PCR反應一般設置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個分子)。
PCR基因擴增儀的PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成。
1.模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；
2.模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；
3.引物的延伸：DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性、退火、延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍。
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