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如何選擇HPLC制備柱

時間:2025/2/13閱讀:546
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如何選擇HPLC制備柱

 

沃特世制備柱應用選擇快速推薦表

應用類型

色譜柱品種

應用特色

常規(guī)反相制備

XBridge C18:實驗室必備柱

BEH 雜化顆粒技術(shù),柱耐受性與通用性更好,pH 1-12

●尤其適用于對胺基類化合物選擇高pH 條件以獲得更好的保留與載量。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH C18 完全一致。

常規(guī)反相制備

SunFire C18:實驗室必備柱

●高純硅膠C18,pH 2-8。載量大、分辨率高,在中-pH 使用范圍內(nèi)通用性極佳。

●特別適用于要求高分辨、高載量的痕量組分制備。

●對于胺基類化合物,當需要使用低pH 條件、甚至甲酸體系時,峰形佳。

常規(guī)反相制備

XSelect CSH C18:實驗室必備柱

CSH 雜化顆粒技術(shù),柱耐受性與通用性極佳,pH 1-11。

●切換氨水/ 甲酸反相體系時柱平衡迅速,特別適用于配MS 引導的制備純化系統(tǒng)。對胺基類化合物峰形卓越。

●色譜選擇性與ACQUITY CSH C18 完全一致,可先用UPLC 進行pH 條件切換篩選,再放大到純化系統(tǒng)進行制備。

極性較大和/或疏水性強的化合物

Atlantis T3

●高純硅膠C18,pH 2-8。有效增強對極性化合物的反相保留,三鍵鍵合C18不易流失,與100% 水相完全兼容,與MS檢測完全兼容。

●同時對強疏水性化合物的保留減弱,有助于減少有機溶劑耗量,并提高對強保留化合物的制備回收率。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC HSS T3 柱類似。

反相無法保留的高極性化合物

XBridge Amide

BEH 雜化顆?;|(zhì),三鍵鍵合酰胺基,耐受性與通用性極佳,pH 2-11。

●按HILIC 原理保留高極性化合物,尤其適用于酸性化合物(如膦酸類)、中性化合物(如寡糖類或多羥基類)或混合組分樣品。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Amide 完全一致。

反相無法保留的高極性化合物

XBridge HILIC

BEH 雜化顆粒基質(zhì),無鍵合相,耐受性優(yōu)于硅膠基質(zhì)柱,pH 1-9。

●按HILIC 原理保留高極性化合物,尤其適用于堿性化合物(如季銨鹽類)。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH HILIC 完全一致。

芳香類化合物或苯基柱應用

XBridge Phenyl

BEH 雜化顆粒技術(shù),柱耐受性極佳,pH 1-12。

●苯基鍵合相對芳香類化合物有特殊的選擇作用。三鍵鍵合苯基有效增強鍵合相耐受性與柱壽命。

●當分離目標還具有胺基或羧基官能團時,可利用不同pH 條件下的選擇性提高載量和分離度。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱完全一致。

合成肽

PST 肽分離技術(shù)柱:

XBridge BEH130 C18

XBridge BEH300 C18

BEH 雜化顆粒技術(shù),柱耐受性與通用性好(pH 1-12),尤其適用于肽分離時常用的TFA 體系及較高溫度。

●填料經(jīng)肽混標質(zhì)控,以確保批次重現(xiàn)性。

●有130? 300? 兩種孔徑可供選擇。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH130 C18 BEH300 C18 完全一致。

合成寡核苷酸

OST 寡核苷酸分離技術(shù)柱

BEH 雜化顆粒技術(shù),柱耐受性與通用性好(pH 1-12),尤其適用于寡核苷酸分離純化所需的高鹽、高溫條件。

●填料經(jīng)寡核苷酸混標質(zhì)控,以確保批次重現(xiàn)性。

●色譜選擇性與ACQUITY UPLC OST C18 柱完全一致。

 

從分析柱到制備柱直接放大,常用計算公式:

放大倍數(shù)-用于估算上樣量:

image.png

流速放大估算:

image.png

  流速可用于計算與分析柱應用時完全相當?shù)木€性流速條件下對應于更大色譜柱的體積流速。但是,合理的流速將取決于柱規(guī)格。當柱長增加、粒徑減小時,柱背壓會相應增加,會受到液相系統(tǒng)耐壓性的限制。

 

梯度持續(xù)時間估算:

image.png

制備柱上樣量預估

對于OBD制備柱的大概上樣量(毫克),梯度洗脫模式時:

image.png

1合理流速取決于柱內(nèi)徑。隨柱長增加及填料粒徑減少,柱背壓增大,使用時會受到液相設備的耐壓性的限制。在制備柱上的梯度持續(xù)時間,應按照與分析柱應用時相等的梯度洗脫體積與柱體積之比的倍數(shù)因子計算(計算公式見“梯度持續(xù)時間估算"公式)

2此處進樣體積數(shù)值基于50 mm柱長并使用較強溶劑溶解樣品時。如增加柱長,進樣體積亦可增加,但并不成正比。使用較弱強度的溶劑溶解樣品,能顯著提高進樣體積量。

 

制備柱的樣品載量受制于許多因素。左邊所列數(shù)據(jù)僅為“平均狀況下"的預估值。通常規(guī)律有:

強保留的目標物載量較大

樣品簡單時載量較大

需要高分辨時載量降低

樣品載量受上樣條件影響很大:

- 受限于樣品體積

- 受限于樣品溶劑的強度

對于肽樣品,其載量主要取決于目標肽序列以及肽樣品的溶解性,建議按所列值的5-20%預估*。

 

裝填技術(shù)與柱硬件對性能的影響

  實驗室規(guī)模的HPLC分離純化對色譜工作者提出了諸多挑戰(zhàn),其中一個最大的挑戰(zhàn)是制備色譜柱本身。由于柱與柱之間在性能和使用壽命上的不一致性,常常導致樣品損失、重復純化操作以及從小體積柱到大體積柱的放大能力差。沃特世科學家意識到這個問題的存在,歷經(jīng)三年,研究了裝填工藝過程中的所有因素以及柱設計本身。在此基礎上,沃特世公司于2003年推出了專利*技術(shù)OBDTM(Optimum Bed Density,最佳柱床密度)應用于沃特世制備

柱產(chǎn)品。(*UK專利號 # GB2408469)。

  問題的根本原因就是在于,制備柱的柱床裝填必須足夠致密,才能在使用過程中能夠承受流動相壓力而仍保持穩(wěn)定的柱床狀態(tài)。傳統(tǒng)的勻漿裝填方法,用于分析柱規(guī)格時能夠產(chǎn)生必需的柱床密度;但是當用于制備柱并使用較小粒徑填充制備柱時,隨著柱內(nèi)徑與長度的增加,就越來越難以達到柱長期使用仍能保持穩(wěn)定耐受時所必需的柱床密度。柱床密度的優(yōu)化,取決于色譜填料的特定性質(zhì)與所采用的柱設計。

image.png

沃特世OBD色譜柱設計

  沃特世已將高壓勻漿填充與經(jīng)過仔細計算的軸向壓縮因素相結(jié)合,應對于柱頭裝填密度較小的部分。

image.png

  按照制備柱OBD設計理念,并按每種填料類型和每種柱規(guī)格的立體幾何學加以精心微調(diào)的實際操作工藝,就可以獲得可預測的、對整個柱床長度都均勻一致的裝填密度。在裝填結(jié)束后的封柱過程中,沃特世柱裝填操作依從仔細嚴格的操作流程,從而確保不會以任何不均勻的方式過度壓縮或擾動柱端部分。

  OBD制備柱硬件設計包括一對精心設計的分流板和化學惰性密封圈,以防止在高壓操作下出現(xiàn)漏液情況。

 

OBD制備柱裝配件圖解

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