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單細胞RNA測序技術（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）已被廣泛應用于免疫學研究中，通過從單細胞水平解析免疫細胞亞群異質(zhì)性，極大地促進了我們對免疫相關亞群的理解。調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells, Treg)是控制免疫穩(wěn)態(tài)*的細胞，具有治療自身免疫的臨床潛力。通過研究得知體外實驗時，一些條件會使部分Treg失去Foxp3轉錄因子的表達，而獲得效應T細胞(Teff)的特性，這一過程被稱為Treg可塑性。免疫應答過程中這種可塑性的程度和可逆性尚不清楚。今天向大家分享一篇近期發(fā)表在Science immunology（IF 17.727）上，利用scRNA-seq鑒定Unstable Treg亞群相關研究的文章“Unstable regulatory T cells, enriched for naïve and Nrp1neg cells, are purged after fate challenge”。

技術亮點
1.BD Rhapsody單細胞多組學分析系統(tǒng)
2.Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq擴增試劑盒（TTA）
3.BD Abseq寡核苷酸偶聯(lián)抗體
4.BD Rhapsody小鼠多樣本標記試劑盒（SMK）
5.BD Rhapsody Analysis Pipeline

研究結果

1.體內(nèi)微生物生理刺激對ex-Foxp3細胞無誘導作用

研究者在本文中通過構建遺傳誘導命運圖譜小鼠技術(圖1A)驗證ex-Foxp3的產(chǎn)生（圖1B），在微生物/抗原暴露下，無特定病原體的小鼠（SPF）與野生型小鼠（Co-house）體內(nèi)都會產(chǎn)生數(shù)量相近、性能一致的ex-Foxp3細胞（圖1C-J）。

 
2. 發(fā)現(xiàn)ex-Foxp3細胞是Treg中的一群unstable Treg亞群

通過遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型驗證，發(fā)現(xiàn)ex-Foxp3細胞是Treg中的一群unstable Treg亞群（圖2A，B，D），會在免疫缺陷的狀態(tài)下轉化生成(圖2F)
 

圖2 Ex-Foxp3細胞的形成是非隨機事件，體內(nèi)unstable亞群清除后Treg的穩(wěn)定性升高

3. Ex-Foxp3細胞對Treg表達的譜系無命運記憶
 進一步通過體外Treg極化條件下培養(yǎng)ex-Foxp3細胞（圖3A，B）、以及通過改進的遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型進行體內(nèi)驗證（圖3C-F），發(fā)現(xiàn)該ex-Foxp3細胞會持續(xù)保持炎癥效應，而且對Treg表達的譜系再無命運記憶（圖3）。

圖3 在體外和體內(nèi)，ex-Foxp3細胞表現(xiàn)出有限的命運記憶

4. 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

BD Rhapsody單細胞多組學技術：TTA（214）+Abseq（5）+SMK

即使損傷改善后、炎癥環(huán)境消除，ex-Foxp3細胞炎癥狀態(tài)也會持續(xù)存在，所以能表征出這個原始異質(zhì)性的Treg亞群很重要。

基于流式技術獲取的動力學數(shù)據(jù)，研究者評估了Foxp3缺失前Tregs基因表達的變化, 選取Tregs (未處理的Foxp3YFP-CreRosaRFP 命運圖譜小鼠中獲取的CD4+ YFP+ RFP+細胞)和將Foxp3YFP-CreRosaRFPTregs和同源naïve T細胞共轉移到Rag1KO（免疫缺陷型）小鼠體內(nèi)后在第5, 10, 和 15天獲取 CD4+ YFP- RFP+ ex-Foxp3細胞(圖4A和圖S10A)。降維聚類(UMAP)分析產(chǎn)生6個細胞亞群(圖4B)。Foxp3基因在所有ex-Foxp3細胞群體中均無表達，與分選報告相對應(圖4C)。依據(jù)不同時間點樣本進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)了三大類基因:快速丟失基因（Treg相關marker）、瞬時富集基因（穩(wěn)定性喪失中起主要作用的基因）和后期富集基因（高度激活的表型相關基因）(圖4D)。

圖4（A-E） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

為了深入了解不穩(wěn)定Treg亞群的起源，研究者進行了基于Pearson相關關系的網(wǎng)絡分析(r 0.95)，以識別第0天與第5天ex-Foxp3細胞最相似的Treg(圖4F)。Inter Treg被確定為富含Unstable Treg的候選亞群，該亞群表達了88%的Treg特征基因，因此Inter Treg群體仍然代表真正的Treg。

圖4（F） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

Inter Treg富集了naïve Nrp1- Treg(圖4G)，流式細胞儀顯示類似，脾臟naïve細胞富含Nrp1- Treg (圖4H)。在22%的第0天Treg中檢測到Nrp1的表達（依據(jù)共表達基因為基礎，可推斷出占群體的89%），只有13%的Inter Treg細胞和7%的第5天ex-Foxp3細胞中檢測到Nrp1 (圖4I)。然而，在Inter Treg亞群中分為Nrp1+和Nrp1neg兩組，Nrp1+和Nrp1-細胞與第5天ex-Foxp3細胞的關聯(lián)性都很高，而與第10天ex-Foxp3細胞的關聯(lián)性很少(圖4I右圖)。第5天ex-Foxp3細胞表達高水平CD62L(圖4E)。在所有Inter Treg差異表達的基因Nrp1在CD62Lhigh部分中特異下調(diào)?？傊@些數(shù)據(jù)提出了一個假設，naïve Nrp1- Treg是異質(zhì)性Treg細胞群中存在的亞群，在淋巴細胞降低的環(huán)境下最容易轉化。

圖4（G-I） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群
 

5. 淋巴細胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

Nrp1表達缺失被認為是外周誘導的Tregs (pTregs)富集的原因。通過BAC-Foxp3Cre-GFP改進的遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型, 將Treg亞群作為一個整體進行流式分選：BAC(GFP)+ Foxp3(Thy1.1)+亞群(tTregs，胸腺來源型Tregs)；BAC(GFP)- Foxp3(Thy1.1)+亞群(pTregs，外周誘導型Tregs)（圖5B）。驗證發(fā)現(xiàn)，與tTregs相比，pTregs中富含unstable Treg（圖5C）?；罨癄顟B(tài)不影響Nrp1- Treg的不穩(wěn)定性（圖5E）。但從ex-Foxp3細胞群形成的絕對數(shù)量來看，這兩個Treg來源的ex-Foxp3百分比幾乎貢獻值同等(圖5F)，并且tTreg部分的不穩(wěn)定性可能主要源于早期和不*確立的新的胸腺轉移細胞（RTE）Treg（圖5D）。

圖5 淋巴細胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

單細胞多組學平臺
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細胞多組學分析系統(tǒng)能夠對成千上萬個單細胞的蛋白與基因進行數(shù)字定量，提供靈活的定制化Panel及標準化應用方案，以滿足不同的實驗需求，其*的混樣技術可有效節(jié)約時間與成本。

系統(tǒng)組成包括：
BD Rhapsody™ 掃描儀
BD Rhapsody™ 上樣臺
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）   
分子標簽試劑和文庫制備
全轉錄組檢測試劑盒/靶向RNA檢測試劑盒/定制試劑盒
Abseq蛋白檢測試劑盒
多樣本混樣檢測試劑盒
VDJ檢測試劑盒
單細胞測序數(shù)據(jù)分析軟件BD SeqGeq