精品国产亚洲国产亚洲,久热中文在线观看精品视频,成人三级av黄色按摩,亚洲AV无码乱码国产麻豆

Bionano OGM是一種強大的光學圖譜技術，它使用超長DNA分子從頭構建整個基因組，并能夠有效地檢測基因組結構變異。同時它還能用于基因組功能分析，如表觀遺傳學、DNA復制圖譜和動力學分析等。其原理是利用熒光標記基因組上特定序列，在納米孔道中電泳拉直DNA后拍照獲得熒光的分布，進而分析特定序列在基因組上的分布和狀態(tài)?；谠撛恚珺ionano研發(fā)團隊和科學界一起開發(fā)了多種熒光標記方法，并不斷探索其在基因組研究中的應用方向。例如基于特殊甲基轉移酶的DLS標記方案和基于基因組缺刻酶的NLRS標記方案。除此之外還有很多特殊的標記方法，其中不乏非常有前景的方向。2019年Bionano研發(fā)團隊與科研工作者在Genome Research雜志上公布了一種基于熒光甲基化圖譜的檢測方案-ROM, 并測試了該方法在面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥 (FSHD)中的應用【1】。

DNA甲基化與研究方法

DNA甲基化在調節(jié)基因表達中發(fā)揮關鍵作用?；騿幼拥募谆癄顟B(tài)可以預測基因活性，且研究發(fā)現發(fā)育過程中和疾病中的DNA甲基化與基因表達和蛋白質豐度相關。目前DNA甲基化的主要研究方法是NGS甲基化測序，即利用不同手段將甲基化和非甲基化的堿基區(qū)分并分別測序。但是甲基化測序需要較高的深度，并且經常需要同時對未處理的原始DNA進行測序比較，因此成本相對較高；同時在基因組中復雜度較低的重復區(qū)域中，由于NGS測得的序列較短，存在比對困難，對于這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)很難解析。三代測序（SMRT和ONT測序）雖然能夠對DNA甲基化狀態(tài)直接檢測，但也存在通量低，成本高的不足。在全基因組光學圖譜（OGM）分析中，增加熒光基團標記甲基化或者非甲基化DNA片段，就可以對全基因組范圍內的甲基化狀態(tài)進行研究。由于OGM檢測單分子超長DNA片段，在分析低復雜的重復區(qū)域中具有先天優(yōu)勢。

ROM標記方案
如圖1所示，ROM標記主要有兩個步驟（具體條件可參考原文【1】）：

缺刻酶介導的NLR全基因組標記: 抽提的超長片段基因組DNA在缺刻酶作用下在對應的基因組片段上產生缺口。隨后利用Taq DNA合成酶進行缺口平移，同時將帶有熒光標記基團的dNTP摻入新合成的鏈中。最后在Taq DNA連接酶的作用下將缺口連接，形成完整的雙鏈。這樣熒光標記就在相應的基因組序列motif附近出現。

M.TaqI甲基轉移酶介導的熒光標記: M.TaqI甲基轉移酶可以在基因組中特定motif(TCGA)的腺嘌呤(A)上轉入一個甲基，但是這個反應會受到鄰近的CpG中C堿基的甲基化或者羥甲基化影響。也就是說一旦TCGA中的C堿基是被甲基化或者羥甲基化的，該反應就會無法完成。ROM分析將甲基轉移反應的底物替換成帶有熒光標記的類似物，就可以區(qū)分出TCGA中的甲基化狀態(tài)。

雙色熒光標記: 抽提的超長片段DNA首先使用NLR缺刻酶全基因組標記并使用紅色熒光標記基團；隨后500ng標記好的DNA使用M.TaqI甲基轉移酶和綠色熒光底物進行第二輪標記；標記完成后使用藍色染料對DNA骨架進行染色。隨后得到的標記染色后的DNA在Bionano OGM平臺上進行電泳和數據收集。

圖1 M.TaqI甲基轉移酶區(qū)分甲基化非甲基化標記原理

ROM可行性驗證
為了驗證該方法的可行性，研究團隊使用ROM 針對FSHD相關區(qū)域（D4Z4 repeats）同時進行了拷貝數和甲基化的分析。

FSHD-associated D4Z4 repeats BAC文庫測試
將正常人的D4Z4區(qū)段轉入BAC文庫后，研究團隊使用多種方法對其進行了分析。

1. 首先使用超高深度（大于15000X）NGS測序，希望利用重復區(qū)域和非重復區(qū)域的測序深度比例來推測拷貝數。然而作者發(fā)現兩種區(qū)域內部的深度變異也非常大（非重復區(qū)域平均差在25%左右，重復區(qū)域更是高達63%），推測會造成估算的不準確。最終利用平均深度的比例，NGS預測D4Z4重復次數為8，但是不確定性非常大。

2. 隨后使用NLR方法將BAC文庫分子標記上紅色熒光基團后，在修飾后的玻片上拉直，熒光顯微鏡下直接觀察。通過直接計數標記個數（D4Z4每一個repeat中都有一個標記位點），直觀得到了準確的D4Z4重復數為22（如圖2）。

圖2 左: D4Z4 repeats BAC文庫示意圖右: 標記后的單個BAC分子

3. 標記后的DNA在Iyrs平臺上進行電泳拍照，利用單分子組裝成D4Z4區(qū)域的完整圖譜。通過和參考基因組的比較得到D4Z4 repeats的個數為22 ± 1（圖3）。

圖3 OGM組裝后的分子和圖譜，灰色區(qū)域為非D4Z4重復區(qū)段

4. 最后針對BAC文庫進行了ROM分析。作者使用紅色熒光來確定基因組標記，綠色熒光來標記甲基化狀態(tài)。使用非甲基化修飾的BAC文庫和部分甲基化的BAC文庫顯示了非常明顯的熒光信號區(qū)別（圖4），從而證明ROM是一種可行的甲基化分析方案。

圖4 甲基化和部分甲基化BAC文庫的ROM分析結果

FSHD 家系樣本測試在一個FSHD家系中，使用ROM分析了一個病人樣本和一個健康親屬樣本?；蚪M組裝結果顯示在FSHD病人中，致病D4Z4重復數（4qA）為4, 而健康親屬的D4Z4重復數（4qA）為26；兩個樣本另外一個等位基因均為非致病性的4qB，且重復數為48（圖5）。

圖5  D4Z4片段重復數，左側為陽性樣本，右側為陰性樣本

ROM分析也發(fā)現FSHD陽性樣本中，無論是D4Z4重復的單個片段甲基化程度（圖6）還是平均甲基化程度（圖7）都明顯低于陰性樣本，從而證明D4Z4重復片段的去甲基化與FSHD疾病的相關。

圖6  ROM分析信號，左側為陽性樣本，右側為陰性樣本

圖7  ROM分析顯示的平均去甲基化程度，左側為陽性樣本，右側為陰性樣本

總結

OGM技術能夠結合多種標記手段，ROM為我們展示了結合基因組骨架標記和甲基化標記的分析方案。相信可以期待更多的特異性或非特異性標記技術與OGM骨架標記結合，完成針對不同應用的分析。