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質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的技巧
閱讀：1236 發(fā)布時(shí)間：2023-1-5
一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原理以及應(yīng)用
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是指利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒DNA通過直接穿膜或膜融合的方法將外源DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞，使外源基因表達(dá)，從而針對(duì)某個(gè)基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行一系列生物學(xué)功能研究的方法。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，DNA轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)實(shí)驗(yàn)工具。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生命科學(xué)前沿研究中，應(yīng)用越來越廣泛。
二、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法
質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞有多種方法，包括物理介導(dǎo)（電穿孔法、顯微注射和基因槍）、化學(xué)介導(dǎo)（磷酸鈣共沉淀法、載體轉(zhuǎn)染法等）和生物介導(dǎo)（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染）三類途徑。這三類技術(shù)中，又以載體轉(zhuǎn)染法最為常用。國(guó)際上應(yīng)用較早的轉(zhuǎn)染載體多為脂質(zhì)體類載體，但此類轉(zhuǎn)染載體細(xì)胞毒性較大，轉(zhuǎn)染效率往往也不夠理想。近年類，納米生物材料類載體的應(yīng)用逐漸增多，此類載體最大的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞毒性較低，部分品牌載體的轉(zhuǎn)染效率也顯著優(yōu)于脂質(zhì)體類載體。
三、如何選擇DNA轉(zhuǎn)染試劑
顯然，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵在于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的選擇，目前常用的DNA轉(zhuǎn)染試劑有RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑、Lipo2000等。如何選擇合適的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑，一般可從以下幾個(gè)方面考慮：
1.對(duì)質(zhì)粒DNA有較高的轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染效率的確定，常用的是使用熒光定量PCR、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法。金標(biāo)準(zhǔn)無疑是檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平，因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑不僅要把質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，還應(yīng)及時(shí)把轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA釋放出來，發(fā)揮基因表達(dá)或基因調(diào)控的作用。通過熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率至少存在兩方面的問題：1、熒光顯微鏡看到的熒光點(diǎn)可能是非特異吸附的結(jié)果；2、有些轉(zhuǎn)染試劑能夠?qū)①|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，但不能充分釋放，導(dǎo)致基因表達(dá)或基因調(diào)控效率并不高。因而，判斷轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率的金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是熒光定量檢測(cè)mRNA水平，僅靠觀察熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率、選擇轉(zhuǎn)染試劑往往會(huì)導(dǎo)致誤判，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。
目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑有RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑、Lipo2000等。其中，Lipo2000為脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑為生物納米材料類轉(zhuǎn)染試劑，是近幾年應(yīng)用較廣的轉(zhuǎn)染試劑。RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑雖在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)，但實(shí)際上也是在美國(guó)研發(fā)成功。就轉(zhuǎn)染效率而言，RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)絕大多數(shù)貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)90%以上（EGFP質(zhì)粒），另外，RFectSP懸浮細(xì)胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑專門針對(duì)懸浮細(xì)胞的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率在大部分懸浮細(xì)胞中高達(dá)70%以上。與之相比，Lipo2000對(duì)大多數(shù)貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率一般為75%左右，對(duì)有些原代細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞根本無法做到有效轉(zhuǎn)染。顯然，從轉(zhuǎn)染效率上說，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑更具優(yōu)勢(shì)。
2.對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性很小。
轉(zhuǎn)染試劑如果毒性過大，會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，這會(huì)直接影響對(duì)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果的判讀和解析。脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑本身會(huì)導(dǎo)致某些基因的表達(dá)改變，因而會(huì)影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。以上可見，應(yīng)盡量選擇毒性較小的轉(zhuǎn)染試劑。
有些研究者對(duì)細(xì)胞毒性不太重視，僅僅考慮是否可將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，其結(jié)果在某些高水平的期刊，往往會(huì)導(dǎo)致審評(píng)的質(zhì)疑。對(duì)于國(guó)內(nèi)常見的幾種轉(zhuǎn)染試劑來說，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑主要由生物納米材料制成，細(xì)胞毒性較低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。Lipo2000屬于脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑，具有脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染載體固有的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性往往較高，轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率有時(shí)在30%以上。
3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類。
目前常見的轉(zhuǎn)染試劑包括RFect、Lipo2000及國(guó)內(nèi)其它廠家的產(chǎn)品，主要轉(zhuǎn)染對(duì)象為貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)懸浮細(xì)胞和原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都不是非常理想。Lipo2000對(duì)原代和懸浮細(xì)胞基本上無法做到有效轉(zhuǎn)染，而且因?yàn)樵?xì)胞較馴化的細(xì)胞株敏感性更高，Lipo2000轉(zhuǎn)染后的死亡率也很高。RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性較低，根據(jù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類不同，可以選購RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑或者RFectSP懸浮細(xì)胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑。