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原代細(xì)胞分離提取方法及注意事項(xiàng)
閱讀：520 發(fā)布時(shí)間：2023-8-21
原代細(xì)胞是直接取自活組織(例如活組織檢查材料)的細(xì)胞，并建立用于體外生長(zhǎng)。這些細(xì)胞經(jīng)歷了非常少的群體倍增，因此與連續(xù)(腫瘤或人工永生化)細(xì)胞系相比，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分，使得原代細(xì)胞成為更具代表性的體內(nèi)模型。
原代細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過程，獲得高純度、高活性的原代細(xì)胞則是很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵要素之一，原代細(xì)胞分離的方法有很多種：懸浮離心法、直接組織塊法、酶消化法、非酶消化法、機(jī)械分散法等。
人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。
(一)機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針)，使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
(二)消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
消化分離法的操作步驟
1)剪切把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
2)加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜，自然沉降法)。
3)消化加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)。
4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
5)漂洗將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入培養(yǎng)基。
6)機(jī)械分散采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)如下
1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。
3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失
三、酶消化法
1）無菌
確保使用無菌設(shè)備、試劑和技術(shù)收集和處理組織。使用個(gè)人防護(hù)設(shè)備以避免污染。使用0.22微米的膜無菌過濾所有酶和試劑。
2）切塊
用無菌剪刀或手術(shù)刀將組織標(biāo)本切成小塊(通常為2×4mm)，然后將小塊放入選定的緩沖液、培養(yǎng)基或鹽溶液中。
3）加酶
將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，約0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶。
4）孵育
將組織樣本在其最佳溫度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分鐘。定期混合或輕輕搖動(dòng)標(biāo)本。
5）洗滌
通過輕輕移液來分散細(xì)胞(也稱為研磨)，然后，使用細(xì)網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液。讓細(xì)胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次。含有FBS，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。
6）分析
將細(xì)胞重懸于正確的培養(yǎng)基或緩沖液中，然后定量測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量和活力。這是細(xì)胞分離過程中的重要步驟，因此您可以評(píng)估解離技術(shù)的結(jié)果。大多數(shù)研究人員使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量，并使用臺(tái)盼藍(lán)重氮染料測(cè)量細(xì)胞活力。
7）培養(yǎng)
這個(gè)適合，就可以根據(jù)所分離的細(xì)胞來選擇適合研究的方案和處理步驟來培養(yǎng)細(xì)胞了。
重點(diǎn)注意事項(xiàng)
1）使用細(xì)胞分離酶時(shí)，請(qǐng)注意溫度和濕度條件。如蛋白水解酶可以自動(dòng)分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2℃～8℃。
2）通常用于細(xì)胞分離的大多數(shù)酶可以直接溶解于平衡鹽溶液或所選緩沖液中。對(duì)于許多細(xì)胞分離中，確保解離期間的組織存活，需要孵育培養(yǎng)基充分氧化并在生理pH下緩沖。95%O2、5%CO2平衡的介質(zhì)來完成。