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一提到安定或地x泮，人們就會(huì)想到抗抑郁藥和抗焦慮藥。如果您有藥理學(xué)背景，您可能還會(huì)想到苯二氮卓（BDZs）這類古老的藥物。但氧化應(yīng)激和腎上腺素能受體的調(diào)節(jié)又是怎么回事呢？羅馬國(guó)立衛(wèi)生研究院的一項(xiàng)新研究對(duì)地x泮等β-AR激動(dòng)劑治療期間β1-和β2-腎上腺素能受體（β1- AR和β2-AR）的調(diào)節(jié)提供了一些令人著迷的見(jiàn)解1。

在這項(xiàng)研究過(guò)程中，研究人員使用了針對(duì) β-ARs 細(xì)胞外表位的特異性抗體和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估單核細(xì)胞中這些受體的細(xì)胞表面調(diào)控。他們發(fā)現(xiàn)地x泮會(huì)刺激氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)劑，進(jìn)而影響細(xì)胞表面的 β1-AR 密度。此外，他們還發(fā)現(xiàn)這些受體不易受激動(dòng)劑介導(dǎo)的下調(diào)影響。

什么是β-腎上腺素能受體？

β-腎上腺素能受體屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族，通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶對(duì)兒茶酚胺做出反應(yīng)。GPCR 具有復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，如下調(diào)細(xì)胞表面受體密度2。

β-ARs亞型β1-、β2-和β3-ARs在組織分布、脫敏機(jī)制和激活特定信號(hào)通路方面各不相同，在控制心臟功能和調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)方面發(fā)揮著不同的作用。因此，人們非常希望了解調(diào)節(jié) β-AR 表達(dá)的機(jī)制，以便針對(duì)與 β-AR 失調(diào)相關(guān)的疾病開(kāi)發(fā)出更有效的療法。因此，在開(kāi)發(fā)治療因 β-AR 失調(diào)引起的疾病的方法時(shí)，β-AR 表達(dá)是研究的首要候選對(duì)象。

雖然人們對(duì)激動(dòng)劑介導(dǎo)的人類β2-腎上腺素能受體下調(diào)了解很多，但對(duì)人類 β1-AR下調(diào)的了解卻較少。有趣的是，一些研究表明，氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié) β-AR 的表達(dá)中發(fā)揮作用3，包括選擇性地降低小鼠心肌細(xì)胞中 β1 腎上腺素能受體的表達(dá)。

外周苯并二氮雜卓受體（PBR）又名線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TSPO），在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、線粒體生理機(jī)能和細(xì)胞能量方面起著至關(guān)重要的作用。它還能使壓力過(guò)大的心肌細(xì)胞的細(xì)胞能量和氧化還原平衡正常化。因此，研究人員假設(shè) PBR 信號(hào)傳導(dǎo)可能參與了細(xì)胞表面 β-AR 密度的調(diào)節(jié)。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們研究了不同的PBR配體如何影響單核細(xì)胞中β1和β2-AR的表面密度。

合適的研究試劑

抗體特異性顯然是所有研究人員都非常關(guān)注的問(wèn)題。但當(dāng)涉及到 GPCR 等具有挑戰(zhàn)性的靶標(biāo)時(shí)，對(duì)抗體的信心至關(guān)重要。本研究的研究人員使用了Alomone的抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表面β1-和β2-腎上腺素能受體的表達(dá)。

研究小組在流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光測(cè)定中使用了FITC 直標(biāo)抗體： Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-023-F)和Anti-β2-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-016-F)。由于這些抗體靶向細(xì)胞外表位，設(shè)計(jì)用于識(shí)別小鼠、大鼠和人類樣本中的β1和β2腎上腺素能受體，因此他們?cè)诒磉_(dá)β1和β2腎上腺素能受體亞型的細(xì)胞（如人類THP-1細(xì)胞）以及缺乏β1-AR、β2-AR或兩種AR的基因敲除（KO）小鼠單核細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)試。

用抗β1-和抗β2-腎上腺素能受體抗體進(jìn)行免疫測(cè)定

(左圖）使用 Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular) Antibody (#AAR-023)（1:400）對(duì)大鼠背側(cè)劍突核和小鼠小腦進(jìn)行免疫組化染色。A. β1-腎上腺素受體染色（紅色）出現(xiàn)在大鼠背側(cè)劍突核的神經(jīng)元中（水平箭頭）。C. 在小鼠小腦的顆粒細(xì)胞（水平箭頭）和浦肯野細(xì)胞層（垂直箭頭）中檢測(cè)到 β1-腎上腺素受體染色（紅色）。B、D. 用 DAPI 作為反染色劑進(jìn)行核染色（藍(lán)色）。(右圖）使用抗β2-腎上腺素能受體（細(xì)胞外）抗體（#AAR-016）（1:100）對(duì)大鼠肺部石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化染色。β2-腎上腺素受體在呼吸道上皮細(xì)胞中表達(dá)。血色素用作反染色。

流式細(xì)胞儀顯示，抗體清楚地標(biāo)記了細(xì)胞表面內(nèi)源性表達(dá) β-AR 的 THP-1 細(xì)胞中的受體。

現(xiàn)在很清楚，Alomone的β-AR抗體能結(jié)合β-AR，但它們能區(qū)分β1和β2-AR嗎？研究小組利用分離自小鼠的外周血單核細(xì)胞顯示，野生型小鼠細(xì)胞中β1-和β2-AR表達(dá)的MFI值明顯高于KO型小鼠細(xì)胞。Alomone 的 β-AR 抗體成功結(jié)合了 β-AR 并區(qū)分了 β1- 和 β2-AR 亞型。抗體驗(yàn)證完成后，研究的三個(gè)主要問(wèn)題就開(kāi)始了：β1-AR 和 β2-AR 是否受 β-AR 激動(dòng)劑的不同調(diào)節(jié)？氧化應(yīng)激和 PBR/TSPO 配體對(duì) β-AR 表面密度有影響嗎？造成 β-AR 表達(dá)變化的機(jī)制是什么？

β1-和β2-腎上腺素能受體是否受到不同的調(diào)控？

以前的研究表明，與β2-AR相比，β1-AR對(duì)激動(dòng)劑的下調(diào)具有抵抗力4。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究人員用腎上腺素或異丙腎上腺素（一種外源性兒茶酚胺）刺激單核細(xì)胞長(zhǎng)達(dá) 48 小時(shí)。流式細(xì)胞術(shù)和Alomone針對(duì)β-ARs的選擇性抗體顯示，內(nèi)源性β2-腎上腺素能受體的細(xì)胞表面密度降低了，而β1-ARs則不受影響。這種對(duì)β-ARs的不同調(diào)控可能對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)不同組織中β腎上腺素能受體的治療藥物具有重要意義。

氧化應(yīng)激會(huì)影響β1-和β2-腎上腺素能受體的密度嗎？

之前的研究表明，通過(guò)急性過(guò)氧化氫或慢性多柔比星治療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)降低心肌細(xì)胞中β1-AR的表達(dá)5，基于這一研究，研究小組想看看氧化應(yīng)激是否也會(huì)影響β1-腎上腺素能受體的密度。

研究人員用地x泮（PBR/TSPO 的配體）處理單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它導(dǎo)致了 β1-AR 密度的降低，但 β2-AR 的豐度沒(méi)有變化。與β-受體阻滯劑普萘洛爾不同，PBR/TSPO拮抗劑PK1119能夠逆轉(zhuǎn)地x泮的作用，這表明PBR/TSPO參與了β1-ARs細(xì)胞表面密度的調(diào)節(jié)。

這一發(fā)現(xiàn)表明，對(duì)β-ARs的影響實(shí)際上并非由氧化應(yīng)激介導(dǎo)，因?yàn)樵诘豿泮處理后沒(méi)有觀察到氧和氮自由基的產(chǎn)生發(fā)生變化。

β1-腎上腺素能受體密度變化背后的機(jī)制是什么？

到目前為止，我們已經(jīng)看到，β1-和β2-AR 在單核細(xì)胞中確實(shí)受到不同程度的調(diào)節(jié)，β1-AR 對(duì)激動(dòng)劑介導(dǎo)的下調(diào)具有更強(qiáng)的抵抗力。相反，暴露于地x泮后，β1-AR 密度降低，我們發(fā)現(xiàn) PBR 拮抗劑 PK11195 可拮抗這種效應(yīng)。為了推斷這些結(jié)果的機(jī)制，研究人員研究了地x泮如何影響轉(zhuǎn)錄和受體合成，以及單核細(xì)胞對(duì) GRK-2 的表達(dá)，GRK-2 是一種參與 β 腎上腺素能受體脫敏和內(nèi)化的激酶6。他們還研究了地x泮對(duì)β1和β2腎上腺素能受體與Gα蛋白亞基或β-arrestin-2相互作用的影響。

有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)地x泮對(duì)β1-AR或GRK-2的mRNA或蛋白水平均無(wú)影響，也不影響β-AR亞型與Gα蛋白或β-arrestin-2的相互作用。然而，PBR/TSPO在調(diào)節(jié)β1-AR表面密度方面的作用似乎很明顯。因此，研究人員推測(cè)地x泮可能會(huì)通過(guò)改變其向質(zhì)膜的再循環(huán)來(lái)影響β1-AR的表面密度。

對(duì)心血管的影響

這項(xiàng)研究為了解β-AR行為和相互作用的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供了重要見(jiàn)解?？紤]到β-AR在心血管治療中的重要性（例如以β-受體阻滯劑的形式），這些研究結(jié)果表明，靶向PBR/TSPO可能是調(diào)節(jié)β1-AR表達(dá)的一種有前途的策略。

這項(xiàng)研究還強(qiáng)調(diào)了驗(yàn)證抗體的重要性，即使是高度特異性的抗體也需要驗(yàn)證！Alomone 的抗體能讓您靈活地使用多種免疫測(cè)定來(lái)揭示最復(fù)雜的機(jī)制。

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References

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