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人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)攻略-原代培養(yǎng)
一、準(zhǔn)備工作
1.儀器設(shè)備
CO2 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機(jī)、水浴鍋（abs72023）或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。
2.試劑耗材
人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9445），基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495），60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）， 100μm濾篩（abs7009），15ml離心管（abs7102），1.5ml EP管若干（abs7119），24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7058）、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷。
人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9445）
試劑盒組成
| 組分名稱 | 規(guī)格 |
| 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A | 100ml |
| 原代培養(yǎng)緩沖液 B | 250ml |
| 人結(jié)直腸癌原代組織消化液 C | 30ml |
| 類器官傳代消化液 D | 30ml |
| 組織保存液 E | 100ml |
| 類器官凍存液 F | 20ml |
| 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G | 250ml |
基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495）
二、操作流程
1. 類器官操作流程之——樣本準(zhǔn)備
（1）將組織放入含有預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液 E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實驗室取回。
（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。
2. 類器官操作流程之——清洗-剪碎
在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）里用2-3ml原代培養(yǎng)緩沖液 B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm3的組織塊，靜置2次。
3. 類器官操作流程之——消化-過濾
（1）向EP管中加入適量人結(jié)直腸癌原代組織消化液 C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進(jìn)行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細(xì)胞或 70um 以下的細(xì)胞簇后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B 終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。
（3）使用100μm濾篩（abs7009）進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15ml離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培養(yǎng)緩沖液 B 轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管，重新重懸離心（清洗二次）。
4. 類器官操作流程之—離心、加膠
基質(zhì)膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）。
5. 類器官操作流程之——點膠-加液
以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500-750μl 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。
6. 類器官操作流程之——觀察
類器官原代培養(yǎng)D1 類器官原代污染
傳代培養(yǎng)
一、類器官傳代培養(yǎng)之-樣本收集
1. 移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2．移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。
二、 類器官傳代培養(yǎng)之-樣本消化
1. 類器官數(shù)量不足或體積較小時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進(jìn)行第3步。
2. 類器官數(shù)量較多或體積較大時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內(nèi)消化 2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6） ，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進(jìn)行第3步。（如圖4）
三、類器官傳代培養(yǎng)之-鋪板
類器官收集后，添加25倍基質(zhì)膠重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如圖9）人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。
四、類器官傳代后增殖現(xiàn)象
類器官凍存
1、移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2、移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。
3. 300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min棄去液體。
4、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存 1管（500個/ml密度凍存），每管體積1.4ml。
5、凍存方法（1）：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
凍存方法（2）：4℃冰箱放置30 min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1 h，最移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
類器官復(fù)蘇
1、實驗前準(zhǔn)備
將水浴鍋預(yù)熱至37℃；
細(xì)胞實驗室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；
在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。
培養(yǎng)箱除菌劑 細(xì)胞房除菌劑
2、取出凍存管
根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。
從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。
凍存管（abs7163）
凍存管（abs72023）
3、迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動，使管中地液體迅速融化。約1-2min后凍存管內(nèi)液體全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
4、將類器官組織液移入15ml離心管，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 10ml重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min。
5、棄上清，添加1ml 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，300g 4℃ 離心 5min，棄去上清。
6、添加25倍基質(zhì)膠（abs9495）重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1），每孔25μl基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。
類器官鑒定
一、類器官鑒定-類器官收集
1、類器官收集
2、清洗1-3遍，洗去大部分基質(zhì)膠，離心棄去大部分上清
二、類器官鑒定-瓊脂糖凹槽制備
三、類器官鑒定-固定
四、類器官鑒定-包埋
五、類器官鑒定-HE染色
六、類器官鑒定-HE染色結(jié)果（以肺癌為例） 
人肺癌類器官HE染色
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