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3T3-L1細胞培養(yǎng)及經(jīng)典“雞尾酒”誘導(dǎo)攻略
流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰(zhàn)，肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發(fā)病率增高，糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在可導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細胞——小鼠胚胎成纖維細胞（前脂肪細胞）系具有向脂肪細胞分化的特性，被廣泛用于研究糖尿病，肥胖癥等。
(圖一）3T3-L1細胞形態(tài)
（表一） 3T3-L1基礎(chǔ)培養(yǎng)信息
| 細胞名稱 | 3T3-L1（小鼠胚胎成纖維細胞） |
| 來源 | 18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎 |
| 生長方式 | 貼壁生長 |
| 細胞形態(tài) | 成纖維細胞樣 |
| 培養(yǎng)條件 | 95%空氣 5%CO2 37℃ |
| 推薦營養(yǎng)體系 | DMEM（abs9483）+10% NBCS（abs978）+1%P/S（abs9244） |
| 傳代 | 0.25%Try（abs47014937）消化5-15min 1:3-1:4傳代 |
| 凍存液配制 | 完quan培養(yǎng)基+5%DMSO(abs9187) |
培養(yǎng)小提示：
1、 Never allow culture to become completely confluent.?。?！細胞匯合度達到70-80%時進行傳代。
2、為了避免細胞聚團，在等待細胞消化的過程中，不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細胞。難以消化的細胞可以放置在37℃。
3、正常培養(yǎng)（非脂肪誘導(dǎo)期）出現(xiàn)空泡時，請優(yōu)先考慮環(huán)境壓力。造成壓力的原因包括培養(yǎng)基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養(yǎng)基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當(dāng)或培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡。
4、使用胎牛血清可能會造成細胞分化！??！
3T3－L1成脂誘導(dǎo)“雞尾酒"策略 
（圖二）3T3-L1細胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（對照）
一般認(rèn)為，細胞的增值和分化呈負相關(guān)，細胞開啟分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是讓其生長至融合期，出現(xiàn)接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉(zhuǎn)化為脂肪酸，然后作為TAGs（甘油三酯）儲存起來的過程。
經(jīng)典“雞尾酒"法中，胰島素樣生長因子（IGF-1）激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導(dǎo)細胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑（IBMX）通過激活cAMP 依賴性蛋白激酶途徑增強 CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族 (C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ( PPARγ) 表達促進成脂分化、地塞米松促進C/EBPs的表達。
3T3－L1經(jīng)典成脂誘導(dǎo)過程
誘導(dǎo)步驟：將融合后的3T3-L1（匯合度100%）細胞從DMEM生長培養(yǎng)基切換到含有0.5 mmol/L IBMX（abs817348）、10 mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養(yǎng)基中48h。然后將細胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基中48h，之后每隔一天更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基，一般第九天染色。
PS:不同產(chǎn)品活性純度不同，濃度僅供參考，不同誘導(dǎo)方案略有差異，IBMX（abs817348）用DMSO溶解時需要超聲破碎。
染色：油紅O儲存液與超純水按 3:2 稀釋混勻，過濾，避光靜置后酒紅色且無沉淀，現(xiàn)配現(xiàn)用,2h內(nèi)用完。
用 PBS 磷酸緩沖液小心漂洗細胞三次，以2mL/孔（六孔板）的劑量加入4%多聚甲醛，室溫固定40min，再用蒸餾水漂洗2次，每孔加入油紅O工作液1mL，常溫染色15min，蒸餾水漂洗至無殘渣，蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。
PS:清洗細胞時動搖要輕柔，防止脂滴脫落，油紅O工作液一定要過濾至無沉淀，否則染色后有殘渣且較難沖洗?。?！
“雞尾酒"誘導(dǎo)策略進擊版
有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導(dǎo)液2（含10mg/mL胰島素的低糖培養(yǎng)基）的作用時間對3T3L1細胞成脂分化率的影響，結(jié)果顯示，低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)時成熟脂肪細胞形成率明顯增高，誘導(dǎo)液2作用時間為3d時，成熟脂肪細胞形成率明顯高于其他組。
注：文中圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用
胞胞巴適本期推薦
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| abs9483 | DMEM高糖培養(yǎng)基（含 L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES） | 500mL |
| abs978 | 新生牛血清（優(yōu)級） | 500mL |
| abs9244 | 青霉素-鏈霉素溶液（100×，雙抗） | 100mL |
| abs47014937 | 胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚紅） | 100mL |
| abs9187 | 二甲基亞砜（細胞培養(yǎng)級） | 50mL |
| abs817348 | IBMX | 25mg |
| abs9294 | 油紅O染色液-改良型 | 3×20ml |
參考文獻
[1] Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2] [1]張軼博,鐘悅,曾瑞霞.HAmLET誘導(dǎo)小鼠前脂肪細胞3T3-L1成脂分化[J].錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報
[3] [1]張曉琴. 優(yōu)化3T3L1細胞成脂誘導(dǎo)模型并初步探討miR-222-3p對脂肪生成的作用[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué)
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