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細(xì)胞培養(yǎng)是每個(gè)實(shí)驗(yàn)者都會(huì)使用的技術(shù)，但是細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中常受到許多不同來(lái)源的污染，如細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素污染等等，其中支原體污染最難發(fā)現(xiàn)和處理。綜合FDA、ATCC等機(jī)構(gòu)收集到的相關(guān)數(shù)據(jù)，世界各國(guó)細(xì)胞系支原體污染的平均比例為30-60%。它們不僅與宿主競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，還會(huì)掩蓋一些化合物毒性影響，因此細(xì)胞受到支原體污染后不但會(huì)抑制生長(zhǎng)和新陳代謝、改變DNA轉(zhuǎn)染效率，甚至最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、重復(fù)性及一致性，所以在實(shí)驗(yàn)中定期做好支原體預(yù)防、檢測(cè)和清除極為關(guān)鍵。

支原體污染細(xì)胞狀態(tài) 圖片來(lái)源網(wǎng)絡(luò)

什么是支原體？

支原體模式圖 圖片引自David S. Goodsell手繪

支原體又稱霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)最微小、能夠自我復(fù)制且不具有細(xì)胞壁的原核生物，直徑大小僅為50-300nm，可通過(guò)濾菌器； 支原體可分為口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、唾液支原體、肺支原體和梨支原體等多種類型。

支原體污染對(duì)細(xì)胞的危害

●抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝；

●干擾核酸合成，染色體畸變；

●改變細(xì)胞膜抗原性，并可能改變DNA轉(zhuǎn)染效率；

●增加了對(duì)凋亡誘導(dǎo)物的敏感性；

●細(xì)胞死亡。

圖片引自Lonza

支原體污染來(lái)源

典型的支原體污染來(lái)源比較廣泛，通常包括以下幾種來(lái)源：

●未檢測(cè)細(xì)胞之間交叉污染；

●實(shí)驗(yàn)室環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的直接污染；

●培養(yǎng)基或其他試劑污染；

●實(shí)驗(yàn)人員無(wú)菌操作不當(dāng)；

●制備細(xì)胞的組織或器官產(chǎn)生污染。

支原體污染的特性

一般細(xì)胞被支原體污染了幾個(gè)月都沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，支原體污染之所以很難檢測(cè)和預(yù)防，是因?yàn)槠渚哂蟹浅８叩碾[蔽性，具體如下：

●體積非常小，即使在支原體高濃度（>107 cfu/ml）下，顯微鏡下也不可見(jiàn)；

●相對(duì)于細(xì)菌污染，支原體污染不會(huì)引起渾濁或PH值改變等可見(jiàn)變化；

●大部分用于細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的抗生素對(duì)支原體無(wú)效；

●常規(guī)的過(guò)濾也無(wú)法去除支原體。

如何預(yù)防支原體污染？

如何進(jìn)行安全的細(xì)胞培養(yǎng)并預(yù)防支原體的污染呢？?jī)?yōu)寧維為大家總結(jié)了十個(gè)技巧：

●穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)備(手套、專用的干凈實(shí)驗(yàn)服、護(hù)目鏡)并消毒手套

●在細(xì)胞處理開(kāi)始前以及處理不同細(xì)胞系之間擦拭安全柜中的工作桌面

●避免在你的細(xì)胞上說(shuō)話或打噴嚏

●避免飛濺、溢出和氣溶膠

●為每個(gè)細(xì)胞系使用zhi定的培養(yǎng)基瓶

●定期清潔培養(yǎng)箱，包括水盤

●定期清空及清潔水浴設(shè)備

●細(xì)胞復(fù)蘇幾天后測(cè)試新細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染

●隔離所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞培養(yǎng)物,直到它們經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)

●不要忘記：每2周進(jìn)行一次支原體的常規(guī)檢測(cè)

如何檢測(cè)和清除支原體污染？

一般來(lái)說(shuō)，新的細(xì)胞株都需要做支原體檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)期間，建議每1-2周進(jìn)行一次支原體檢測(cè)以防止污染。因此，在實(shí)驗(yàn)室的日常研究需求中，需要一種快速、全面的檢測(cè)方法以應(yīng)對(duì)日常的檢測(cè)需求。

支原體檢測(cè)——Lonza MycoAlert™支原體快檢

1、檢測(cè)原理

目前，在95%支原體污染來(lái)自6個(gè)種屬，在這些種屬和大多數(shù)的柔膜細(xì)菌中，存在兩種酶，乙酸激酶和氨基甲酸激酶，MycoAlert™通過(guò)檢測(cè)兩種酶的活性，完成支原體檢測(cè)。僅需兩步簡(jiǎn)單操作，20分鐘即可完成檢測(cè)。這兩種酶在真核細(xì)胞中不存在，因此，既可保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又可快速完成檢測(cè)。

2、檢測(cè)方法

3、數(shù)據(jù)解讀

4、產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.只需兩步操作，20分鐘內(nèi)出結(jié)果；

2.生物發(fā)光技術(shù)，無(wú)需抽提DNA；

3.MycoAle-t™ PLUS試劑盒可用于低敏板式發(fā)光儀或多功能發(fā)光儀上；

4.可檢測(cè)所有常規(guī)的支原體和甾原體的污染

5.可檢測(cè)44種柔膜菌綱（支原體）物種

6.適用于研究中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的篩選

7.適用于檢測(cè)新的培養(yǎng)基，水，添加物（如血清等）

支原體清除——Lonza MycoZap™支原體去除試劑

支原體無(wú)法通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾去除。由于支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)抗生素（如青霉素）對(duì)它也不起作用。多數(shù)情況實(shí)驗(yàn)者丟棄已污染樣品。但是有時(shí)實(shí)驗(yàn)者出于某些原因不能丟棄已污染的樣品，就可以通過(guò)MycoZap™支原體去除試劑在4天內(nèi)清除支原體。挽救他們的樣品。

1、作用原理

它通過(guò)抗生素和抗代謝藥劑的共同作用來(lái)終止支原體。這種方法高效可靠的去除支原體，解決單獨(dú)的抗生素對(duì)支原體不起作用的問(wèn)題。MycoZap™支原體試劑可清除細(xì)胞培養(yǎng)中的柔膜綱污染包括支原體、甾原體、螺原體、蟲(chóng)原體。

2、使用方法

1.在25cm2的培養(yǎng)瓶中添加4.5 ml培養(yǎng)基（胎牛血清<5%）；

2.在培養(yǎng)基中加入500µl的MycoZap™ reagent 1，輕輕旋轉(zhuǎn)混合；

3.在培養(yǎng)基(含5% (v/v)胎牛血清)中制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為105個(gè)/ml；

4.向MycoZap™培養(yǎng)基混合液中加入5 ml細(xì)胞懸液；

5.根據(jù)細(xì)胞增殖速率，正常孵育2-6天；

6.在傳代之前，取2ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用MycoAlert™試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；

7.將細(xì)胞正常傳代至9.5ml新鮮培養(yǎng)基中；

8.向細(xì)胞中加入500µl的MycoZap™ reagent 2；

9.檢測(cè)陰性后即可正常培養(yǎng)細(xì)胞。

3、產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.全面、徹di的支原體去除試劑

●消滅支原體、甾原體、螺原體、蟲(chóng)原體

●通過(guò)抗生素與抗代謝藥劑的聯(lián)合作用有效去除柔膜綱物種

2.有效而溫和

●細(xì)胞毒性最小化

●廣泛地適用于細(xì)胞培養(yǎng)

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